檢測口蹄疫抗體間接ELISA方法的建立和應用以及新型佐劑對口蹄疫疫苗的免疫增強作用.pdf

1、1 FMDV vp1基因的克隆及表達 參照GenBank中的O型FMDV(foot-and-mouth disease virus，FMDV)的vpl基因序列設計了一對特異性引物，用PCR方法擴增得到一969bp的DNA片段，測序后以該片段為模板，用特異性表達引物擴增得到目的基因vpl(652bp)。然后克隆到pMD18-T載體中，從T-載體中切下目的片段，定向克隆到pGEX-4T-2中，轉化BL21 (DE3)，經IPTG誘

2、導后，進行SDS-PAGE實驗，目的基因獲得高效表達，免疫轉 印鑒定呈陽性，vpl基因體外獲得成功表達。 2 FMDV 3abc基因的克隆及表達 將O型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)非結構蛋白基因3ABC首先克隆入pMD18-T Vector，然后亞克隆到原核表達載體pGEX-4T-2上，成功構建重組表達質粒pGEX／3ABC。將其轉化大腸桿菌Rosetta(DE3)感

3、受態(tài)細胞中表達，表達產物經SDS-PAGE可檢測到分子量約為71kD的目的蛋白帶，經薄層掃描分析，目的蛋白約占菌體總蛋白的15％。Western blotting分析證明表達產物能被FMDV陽性血清所識別。 3 表達蛋白VPl和3ABC的間接ELISA的建立及應用 FMDV的兩種表達產物(VPl，3ABC)經GST.Bind Resin純化后，作為抗原建豆了間接ELISA(VPl-ELISA，3ABC-ELISA)，VP

4、l、3ABC抗原包被濃度分別為58.25 μ g／ml，7.84μg／ml，血清檢測稀釋度均為1:40 ，抗原與抗體的最佳反應時間為120min。 應用VPl-ELISA和液相阻斷ELISA診斷試劑盒同時檢測400份臨床樣品，試劑盒的檢出率為88.25％，VPl-ELISA的檢出率為86.25％，二者的符合率達98％。 應用3ABC-ELIsA和蘭州獸醫(yī)研究所的NSP-ELIsA診斷試劑盒同時檢測400份臨床樣品，試劑盒

5、的檢出率為3％，VPl-ELISA的檢出率為4％，二者的符合率達99％。 結果表明VPl-ELISA可以用于監(jiān)測牛血清抗體水平變化，3ABC-ELISA可用于區(qū)分滅活疫苗免疫和野毒感染。4 LTB的克隆與表達 通過PCR擴增LTB蛋白全基因片段的，將其按正確的閱讀框架定向克隆到表達載體pET 32a中；用此重組質粒pET 32a/LTB轉化大腸桿菌BL21(DE3)codon plus菌株，在濃度為lmM IPTG和30℃條件

6、下誘導表達；經SDS-PAGE及免疫轉印鑒定結果顯示：重組蛋白具有免疫原性。5新型佐劑對FMDV抗原的免疫增強作用 重組表達的LTB蛋白經鎳柱純化后透析復性，然后與STET-CTAB法提取的細菌CpGNDA分別單獨和共同與O型FMD滅活疫苗聯用，分6組共免疫60只豚鼠，分別用間接ELISA和終點法檢測不同免疫階段的126份豚鼠血清樣品的血清抗體校價和中和抗體水平。結果表明，單獨的CpG組比傳統的油佐劑組效果稍好，而當LTB與CpG共同