HBx蛋白誘導肝癌細胞上皮-間葉樣表型轉化及其分子機制初步探討.pdf

1、既往大量研究提示乙肝病毒和肝細胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)發(fā)生關系密切，然而關于乙肝病毒對肝細胞癌侵襲轉移影響的研究卻很少；近年來，鑒于發(fā)現乙肝病毒X基因編碼的HBx蛋白可以激活多個與腫瘤侵襲轉移相關的原癌基因(如c-Src等)及轉錄因子，HBx蛋白在肝細胞癌侵襲轉移中的調控作用開始引起關注。由于在HBx蛋白所激活的諸多原癌基因/信號通路中，酪氨酸激酶家族的c-Src是介導上皮-間葉樣表型轉化的關鍵因子

2、之一，因此我們推想：HBx蛋白是否可以通過激活c-Src來誘導肝癌細胞發(fā)生上皮-間葉樣表型轉化，從而促進其侵襲轉移呢? 上皮-間葉樣表型轉化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)指上皮細胞獲得了成纖維細胞樣表型，其特征是細胞標志物改變和細胞內骨架重排等，其結果是細胞間粘附減弱、細胞運動能力大大增強。 為了檢驗我們的假想，本實驗設計如下：首先，在肝細胞癌組織標本上，用免疫組化方法檢測了

3、HBx、活化型c-src、上皮標志物(E-cadherin、β-catenin、α-catenin)、間葉標志物(N-cadherin、vimentin、fibronectin)在肝細胞癌組織的表達，并評價其臨床意義；然后，構建含HBx基因的重組腺病毒載體，包裝產生腺病毒，并進一步感染SMMC-7721細胞。觀察轉染HBx基因后的SMMC-7721細胞的形態(tài)變化，并檢測上皮標志物和間葉標志物的表達情況。再給予c-src激酶抑制劑PP2和

4、陰性對照PP3，評價HBx蛋白是否通過活化c-Src來發(fā)揮誘導作用。最后，將腺病毒感染的SMMC-7721細胞接種到裸鼠皮下和脾臟，評價HBx蛋白對肝癌細胞在裸鼠體內生長和轉移的影響。 本組實驗主要的結果及結論如下： 1.76例肝細胞癌組織中，有52例(52/76，68.4％)HBx表達陽性，有38例(38/76，50％)活化型c-Src表達陽性；上皮標志物在肝癌細胞膜的表達情況是，26例E-cadherin表達缺失(2

5、6/76，34.2％)，18例α-catenin(18/76，23.7％)表達缺失，15例β-catenin(15/76，19.7％)表達缺失；間葉標志物在肝癌細胞漿的表達情況是，N-cadherin有42例(42/76，55.3％)表達陽性，Vimentin有9例(9/76，11.8％)表達陽性，Fibronectin有35例(35/76，46.1％)表達陽性。統計分析顯示，E-cadherin和β-catenin等上皮標志物在肝癌細

6、胞膜上的表達缺失，以及N-cadherin、Vimentin、Fibronectin等間葉標志物在肝癌細胞漿中的陽性表達均與腫瘤靜脈侵襲等相關，這就提示在肝癌細胞中，上皮標志物的表達減弱和間葉標志物的表達增強，可能協同促進了肝細胞癌侵襲轉移；統計分析還表明，HBx表達和c-Src活化顯著相關，并且兩者均與E-cadherin表達缺失和N-cadherin陽性表達相關；這就提示，在肝癌細胞中，HBx可能通過活化c-Src同時調控了上皮標志

7、物和間葉標志物的表達。 2.經過基因測序和酶切鑒定，HBx基因正確插入到所構建的重組腺病毒載體中，熒光顯微鏡下包裝細胞中見到綠色熒光蛋白(GFP)表達；因此我們成功構建了攜帶HBx基因的重組腺病毒載體及其陰性對照空載體；在腺病毒感染的靶細胞中，熒光顯微鏡下可見GFP表達，RT-PCR檢測到HBxmRNA表達，Westernblotting和免疫細胞化學等方法檢測到HBx蛋白表達。這說明，我們制備的重組腺病毒成功感染肝癌細胞株SM

8、MC-7721，目的基因得到高表達。 3.腺病毒感染SMMC-7721細胞一周后，空載體對照組細胞維持母細胞的上皮樣表型，而含HBx基因的實驗組細胞轉化為梭形，細胞離散；給予PP2后，實驗組細胞由梭形恢復原來的上皮表型，而給予PP3后細胞形態(tài)無明顯變化。這初步說明，HBx蛋白可以誘導肝癌細胞發(fā)生上皮-間葉樣表型轉化，而c-Src活化在其中發(fā)揮了關鍵作用。通過RT-PC、Westernblotting和免疫細胞化學等方法進一步檢測

9、轉染HBx基因后，肝癌細胞標志物的表達變化，發(fā)現上皮標志物E-cadherin和α-catenin在實驗組細胞中的表達水平顯著低于對照組細胞，而間葉標志物N-cadherin、Vimentin、Fibronectin等在實驗組細胞中的表達顯著高于對照組；實驗組細胞給予PP2后能夠逆轉上述HBx基因轉染的效應，而給予PP3后無明顯變化。這進一步提示，HBx蛋白通過活化c-Src誘導肝癌細胞發(fā)生了上皮-間葉樣表型轉化。 4.細胞運動

10、實驗和細胞侵襲實驗結果顯示：轉染HBx基因的實驗組細胞運動能力和侵襲能力顯著強于對照組細胞；腺病毒感染的細胞接種到裸鼠脾臟后，實驗組細胞形成的肝轉移灶數目顯著多于對照組。因此上述體外實驗和體內實驗結果都提示，HBx蛋白誘導肝癌細胞發(fā)生上皮-間葉樣表型轉化后，促進了肝癌細胞運動侵襲能力提高。 5.轉染HBx基因后，SMMC-7721細胞生長曲線左移，倍增時間縮短，說明HBx蛋白促進了肝癌細胞生長；體內實驗顯示，轉染HBx基因的實驗

11、組細胞在裸鼠皮下和脾臟接種后，形成的腫瘤體積和重量均顯著大于對照組；因此，HBx蛋白促進了肝癌細胞生長。 綜上所述，本研究主要結論如下： 1.HBx蛋白可以誘導肝癌細胞發(fā)生上皮-間葉樣表型轉化，其特征是肝癌細胞形態(tài)轉化為梭形，E-cadherin等上皮標志物表達下調，而N-cadherin、Vimentin、Fibronectin等間葉標志物表達增強；而且發(fā)生上皮-間葉樣表型轉化后，肝癌細胞在體內、體外的運動和侵襲轉移能