黏蟲ABC轉運蛋白基因的表達與功能分析.pdf

1、黏蟲Mythimna separata(Walker)是一種多食性昆蟲，由于其具有遠距離的遷飛習性，導致其在我國危害范圍廣，給我國的農業(yè)生產上造成了巨大的經濟損失。隨著轉基因作物在全世界范圍大規(guī)模的推廣種植，在減少化學殺蟲劑的使用的同時也高效的控制住了相關害蟲的為害?，F(xiàn)有的轉基因作物絕大部分是轉Bt（Bacillusthuringiensis）基因，因為其產生的殺蟲晶體蛋白對昆蟲有著特異性殺蟲作用，但隨著其對害蟲的選擇壓力的增加，相關害

2、蟲對Bt抗性問題已經日益嚴峻，本研究則是以黏蟲為研究對象，在已經獲得黏蟲ABC(ATP-binding cassette)轉運蛋白MsABCC2(GenBank登錄號為KJ930171.1)和MsABCC3基因cDNA全長的基礎上，測定了該基因在幼蟲體內不同齡期及不同組織中的相對表達量，同時使用RNAi(RNA interference)技術研究了ABC轉運蛋白的功能。主要結果如下:
　　1.黏蟲幼蟲MsABCC2和MsABCC3

3、蛋白基因的相對表達量
　　利用實時熒光定量PCR技術，以β-actin為內參基因，結果采用2-△△CT分析方法，得到了幼蟲在不同齡期和不同組織中的MsABCC2和MsABCC3的相對表達量。結果顯示:在不同齡期幼蟲中MsABCC2蛋白基因表達量差異顯著(P＜0.05)。6齡幼蟲體內的基因相對表達量最高，但與4齡、5齡幼蟲并沒有顯著性差異;3齡幼蟲體內的基因相對表達量最低，但與2齡幼蟲并沒有顯著差異。對于MsABCC3而言，6齡幼蟲

4、體內的基因相對表達量最高，與其他齡期均有顯著性差異，5齡幼蟲體內的基因相對表達量最低，與4齡幼蟲相比差異顯著，但與2齡和3齡幼蟲并沒有顯著差異。在檢測4～6齡幼蟲中腸和除中腸之外的蟲體MsABCC2和MsABCC3蛋白基因表達量中，發(fā)現(xiàn)4～6齡的幼蟲中腸中MsABCC2和MsABCC3蛋白基因的相對表達量均顯著的高于除中腸之外的蟲體，可以說明MsABCC2和MsABCC3大部分在黏蟲幼蟲的中腸處表達。
　　2.黏蟲ABC蛋白基因的

5、RNAi和沉默后的生物學測定
　　根據(jù)MsABCC2和MsABCC3基因序列分別設計了3個siRNA，分別為si2-1、si2-2、si2-3和si3-1、si3-2、si3-3，通過喂食法進行RNA干擾。利用實時熒光定量PCR檢測了喂食了siRNA24h、48h和72h后MsABCC2和MsABCC3蛋白基因的相對表達量，結果表明:喂食si2-124h后，幼蟲體內MsABCC2蛋白基因的相對表達量相比對照顯著地降低了(P＜0.0

6、5）;喂食si3-1和si3-372h后，幼蟲體內MsABCC3蛋白基因的相對表達量相比對照顯著地降低。在得到有效的siRNA的片段后，進一步檢測了在沉默MsABCC2和MsABCC3蛋白基因的表達后，其是否會影響?zhàn)はx對于Cry1Ac殺蟲蛋白的敏感性。結果表明，黏蟲幼蟲MsABCC2的表達被抑制后取食含有Cry1Ac毒蛋白的人工飼料，7天后其死亡率顯著低于對照組(P＜0.05)，且未死亡的幼蟲其體重也顯著高于對照。其結果表明，黏蟲對于C