結直腸癌中EHD2、PDLIM7表達的蛋白質組學研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　 惡性腫瘤嚴重威脅人類健康。結直腸癌是常見的胃腸道惡性腫瘤。在我國，結直腸癌的發(fā)病率和死亡率逐年上升，目前居于第4位。在我國大城市中，結直腸癌發(fā)病人數(shù)以每年4％的增長速度上升。由于人們生活方式、飲食結構的改變，平均壽命的提高，結直腸癌的發(fā)病率還有進一步上升的可能。結直腸癌在全世界每年新發(fā)病120萬例，確診后，患者的5年存活率僅55％。
　　 造成這種現(xiàn)狀的原因主要有3個:1、結直腸癌的病因不明確，因

2、此無法做到有效的一級預防;2、缺乏便捷、高效的診斷方法，這種情況使腫瘤的二級預防成為空談;3、治療手段雖多，但總體療效不理想，且治療過程中的副作用給患者帶來的痛苦遠大于其益處。因此，對結直腸的研究，無論是病因還是篩查、早期診斷，或是治療方式方法，都有可能使現(xiàn)患病者和高危人群以及其他潛在患者受益。
　　 目前結直腸癌常用的診斷方法有:1、內鏡檢查，如纖維結腸鏡、電子結腸鏡;2、血清學檢查，多種腫瘤標志物的檢測;3、影像學檢查，如C

3、T、MRI、胃腸道鋇餐造影、TRUS(經(jīng)直腸超聲檢查)等;4、其他檢查，如基因學檢查。以上各種方法均不同程度地存在病人依從性差、特異度和檢測靈敏度不高等問題。在治療方面，除了對已有治療手段的不斷改進，新藥的開發(fā)，尤其是靶向藥物的開發(fā)也取得了豐碩的成果。此外，對結直腸癌治療的認識也發(fā)生了轉變，個體化治療為越來越多的人接受并得到前所未有的重視，它的基礎是明確的靶點和有效的療效預測蛋白。
　　 隨著蛋白質組學，尤其是疾病蛋白質組學的不

4、斷發(fā)展，大量的疾病差異蛋白被發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過后續(xù)研究，從中遴選出疾病的診斷、分子治療及其預后判斷的分子生物學標志物。蛋白質組學的進步離不開蛋白質組學技術的迅猛發(fā)展。同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)技術功能強大，能同時對多個樣品進行相對和絕對定量研究。多維液相色譜分離和串聯(lián)質譜(LC/MS)聯(lián)合iTRAQ技術能得到完整的疾病蛋白質

5、組，并能定量其中的蛋白。本研究旨在應用這種蛋白質組學技術，通過對正常結直腸粘膜及結直腸癌腫瘤組織進行分析，鑒定并驗證得到對結直腸癌有診斷或治療意義的分子標志物。
　　 方法:
　　 1、研究對象
　　 5例結直腸癌患者的正常結直腸粘膜及結直腸腫瘤組織。
　　 2、組織標本的收集
　　 (1)新鮮組織標本的收集:在手術中，標本離體后30分鐘內收集新鮮組織標本，深低溫保存;
　　 (2)石蠟組

6、織標本的收集:組織標本經(jīng)福爾馬林固定后制成蠟塊以備檢測。
　　 3、iTRAQ聯(lián)合LC/MS鑒定結直腸癌腫瘤組織與正常結直腸粘膜差異蛋白
　　 分別將5例正常粘膜樣本蛋白及5例腫瘤組織樣本蛋白混合，經(jīng)胰酶消化以后，用iTRAQ定量試劑盒分別標記上述兩種組織蛋白。首先用強陽離子交換對上述蛋白混合物進行第一維分離，根據(jù)峰型和時間共收取20個梯度;然后采用反相色譜與質譜聯(lián)用技術對上述樣品進行第二維分離，據(jù)此采集多肽質譜圖并對蛋

7、白質進行定量;經(jīng)數(shù)據(jù)庫搜索，描繪出結直腸癌組織差異蛋白質譜。結合生物信息學數(shù)據(jù)庫分析差異蛋白質亞細胞定位和功能并篩選出目的蛋白。
　　 4、免疫組化檢測目的蛋白在組織中的亞細胞定位
　　 以免疫組織化學法檢測其表達水平。收集58例結直腸癌腫瘤組織和遠端正常粘膜組織，經(jīng)福爾馬林固定后，行石蠟包埋，然后切片。組織切片經(jīng)脫蠟至水、高壓修復抗原、雙氧水封閉內源性酶后，順序孵育一抗、二抗;然后用DAB顯色、再經(jīng)過蘇木素復染。采用雙

8、盲法由兩位病理學醫(yī)師對實驗結果進行判斷。診斷標準:在5個視野觀察200個上皮細胞，觀察染色強度和陽性細胞數(shù)后進行打分，兩者相加之和即為評分。根據(jù)陽性細胞的百分比打分的標準:0分——陰性;1分——陽性細胞數(shù)＜10％;2分——11％≤陽性細胞數(shù)＜50％;3分——51％≤陽性細胞數(shù)＜80％;4分——陽性細胞數(shù)≥80％。根據(jù)染色強度進行打分的標準:0分——無;1分——弱陽性;2分——中等陽性;3分——強陽性。
　　 5、Western-

9、blotting實驗
　　 用Western-blotting實驗驗證目標差異蛋白的表達。取適量樣本蛋白行SDS-PAGE，然后轉膜，順序孵育一抗、二抗。然后用電化學發(fā)光法顯示條帶。所得條帶用PD QUEST軟件進行半定量分析。
　　 4、q RT-PCR檢測目的基因的表達
　　 通過q RT-PCR檢測EHD2、PDLIM7的基因在結直腸癌腫瘤組織及正常粘膜組織中的表達。
　　 結果:
　　 1

10、、iTRAQ聯(lián)合LC/MS鑒定組織差異蛋白質
　　 共鑒定到802個蛋白。認定差異蛋白質的標準-1、含量差異P＜0.05，2、在正常組織與腫瘤組織中的含量比值≥1.5或≤0.5。同時滿足以上2項的即為差異蛋白。共有68個差異蛋白（33個上調，35個下調）。經(jīng)Swiss-Prot和GeneOntcology數(shù)據(jù)庫搜索，差異蛋白定位于細胞核、細胞漿、細胞膜和細胞外基質，其功能與細胞粘附、細胞結構、信號轉導、結合等相關。從中挑選了EH

11、D2及PDLIM7進行驗證。
　　 2、免疫組織化學結果
　　 EHD2表達于84.48％的正常粘膜組織，在結直腸癌腫瘤組織中低表達，僅表達25.86％。
　　 PDLIM7表達于81.03％的正常粘膜組織，在結直腸癌腫瘤組織中低表達，僅表達29.31％。
　　 3、Western-blotting和qRT-PCR實驗
　　 證實了EHD2及PDLIM7在結直腸癌組織中表達低于正常粘膜組織。