應用蛋白敲除技術(shù)降解ErbB家族的抗乳腺癌作用及其機制研究.pdf

1、分類號：密級：學位類別：R7379科學學位團專業(yè)學位口學校代碼：學號：學科門類：100622010601042醫(yī)學又亨章眚科矢辱博士學位論文DOCTORALDISSERTATION論文題目：應用蛋白敲除技術(shù)降解ErbB家族的抗乳腺癌作用及其機制研究TITLE：StudyonsimultaneoustargetingoftheentireErbBreceptortyrosinekinasesfordegradationbytheprote

2、inknockoutsysteminbreastCanCer一級學科：臨床醫(yī)學二級學科：腫瘤學論文作者：孔凡銘指導教師：郝希山教授導師組成員：任秀寶李慧周蓬勃天津醫(yī)科大學研究生院二。一三年五月天津醫(yī)科大學博士研究生學位論文中文摘要目的：采用“蛋白敲除”技術(shù)一即調(diào)控SCF泛素一蛋白水解酶的底物特異性，降解乳腺癌細胞內(nèi)磷酸化的ErbB家族蛋白，在細胞及動物模型中觀察對乳腺癌細胞增殖、化療敏感性以及細胞惡性轉(zhuǎn)化的影響；探討、研究蛋白敲除技術(shù)降

3、解ErbB家族的抗腫瘤機制，為開發(fā)針對ErbB家族的新型抗腫瘤靶向藥物提供理論基礎(chǔ)。方法：1、(1)為驗證前期所構(gòu)建peDNA30FTrcpShe和pcDNA30F—TrcpShc(F198V)質(zhì)粒的功能，瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞，免疫共沉淀(Co—IP)法檢測FTrcp—She泛素連接酶與ErbB蛋白的相互作用；Westernblotting檢測FTrcp—Shc對ErbB蛋白的降解作用；將相應質(zhì)粒與HisUb共轉(zhuǎn)染293T細胞，檢測FT

4、rcp—Shc對ErbB2泛素化作用的影響；(2)將peDNA30FTrcp—Shc和pcDNA30一F—TrcpShe(F198V)質(zhì)粒酶切，亞克隆入pBMNGFP，構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBMN—GFP—F—TrcpShe及pBMNGFPFTrcp—She(m)，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)大腸埃希菌，篩選陽性克隆，經(jīng)酶切、測序鑒定：(3)將重組質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒pAmpho共同轉(zhuǎn)染人胚胎腎上皮細胞系293T細胞，包裝獲得攜帶目的基因

5、的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒；(4)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染ErbB過表達乳腺癌細胞系SKBR3、BT474，流式細胞儀分選GFP陽性表達細胞，Puromycin加壓篩選7天，Westemblot檢測Flag蛋白表達。2、(1)WesternbloRing、RealtimePCR檢測篩選后乳腺癌細胞系SKBR3及BT474中ErbB家族的蛋白、mRNA表達情況；流式細胞儀檢測ErbB家族膜蛋白表達情況；(2)Westernblotting檢測蛋白酶體抑制劑M

6、Gl32、溶酶體抑制劑氯喹對F—TrCP—ShcE3泛素連接酶誘導ErbB家族蛋白降解的抑制作用；(3)Westernblotting檢測FTrCPSheE3泛素連接酶降解乳腺癌細胞內(nèi)ErbB家族蛋白對其下游信號通路活性的影響。3、(1)在細胞模型中，通過細胞計數(shù)、AnnexinV／PI雙染色法、X1vr、平板克隆形成實驗等方法，觀察蛋白敲除方法降解ErbB家族對細胞增殖、細胞凋亡、化療敏感性以及細胞惡性轉(zhuǎn)化的影響；(2)通過乳腺癌細胞