AMPK激活劑調(diào)節(jié)p21CIP、p27KIP、cyclinD1誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞周期停滯.pdf

1、背景及目的：
　　腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是細(xì)胞能量調(diào)節(jié)的感受器。研究資料表明,AMPK激活劑二甲雙胍及AICAR可對(duì)多種腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生增殖抑制作用,其功能與AMPK對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控作用密切相關(guān)。目前有關(guān)AMPK激活劑對(duì)肝癌細(xì)胞增殖抑制、細(xì)胞周期影響的報(bào)道較少,未見(jiàn)詳細(xì)機(jī)制的報(bào)道。本研究將通過(guò)AMPK激活劑二甲雙胍及AICAR對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2的增殖抑制、細(xì)胞周期影響

2、及其作用機(jī)制的研究,為AMPK成為抗腫瘤治療的新靶點(diǎn)提供新的理論依據(jù)。
　　材料和方法：
　　1.用含10％胎牛血清,100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞。
　　2.用含不同濃度二甲雙胍(2.5、5.0、10、20mM),AICAR(50、100、250、500μM)的培養(yǎng)基分別處理HepG2細(xì)胞24、48、72h,以未予藥物處理細(xì)胞為對(duì)照,噻唑藍(lán)比色法(M

3、TT法)檢測(cè)二甲雙胍及AICAR對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響。
　　3. HepG2細(xì)胞用含10mM的二甲雙胍的培養(yǎng)基和500μM的AICAR的培養(yǎng)基作用72h,經(jīng)碘化丙啶(PI)單染法,用流式細(xì)胞分析儀(FCM)檢測(cè)HepG2細(xì)胞周期情況。
　　4.用含10mM的二甲雙胍培養(yǎng)基和500μM的AICAR的培養(yǎng)基作用HepG2細(xì)胞24h, Western Blot檢測(cè)AMPK磷酸化程度、以及G1/S調(diào)節(jié)點(diǎn)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白p21C

4、IP、p27KIP、cyclin D1、CDC2、CDK2表達(dá)量。
　　5. HepG2細(xì)胞用含10mM的二甲雙胍的培養(yǎng)基和500μM的 AICAR的培養(yǎng)基作用24h,DAPI染色后熒光顯微鏡下觀察HepG2細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　1. Western blot結(jié)果顯示,經(jīng)二甲雙胍及AICAR處理后,HepG2細(xì)胞AMPK磷酸化程度較對(duì)照組增強(qiáng)。
　　2. MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,二甲雙胍及A

5、ICAR能抑制HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng),并且呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,HepG2細(xì)胞經(jīng)二甲雙胍及AICAR處理24h后,細(xì)胞周期發(fā)生G0-G1期停滯,G0-G1期百分比和對(duì)照組相比較,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4. Western Blot結(jié)果顯示,經(jīng)二甲雙胍及AICAR處理后,HepG2細(xì)胞p21CIP和p27KIP表達(dá)較對(duì)照組增強(qiáng),cyclin D1表達(dá)較對(duì)照組減弱, CDK2、CDC2表達(dá)與對(duì)照

6、組比較無(wú)明顯變化。
　　5. DAPI染色觀察可見(jiàn),HepG2細(xì)胞經(jīng)二甲雙胍及AICAR處理24h后,鏡下可見(jiàn)部分細(xì)胞核碎裂,細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　結(jié)論：
　　1. AMPK激活劑誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞增殖抑制。
　　2. AMPK激活劑誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生G0-G1期細(xì)胞周期停滯。
　　3. AMPK激活劑磷酸化激活HepG2細(xì)胞AMPK,上調(diào)p21CIP、p27KIP表達(dá)量,下調(diào)cyclinD1表達(dá)量,CD