核苷酸切除修復(fù)基因甲基化及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控在砷致病機(jī)制中作用.pdf

1、研究背景:地方性砷中毒是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病，該病不僅引起皮膚、肝臟等多系統(tǒng)、多臟器損害，危害更大的是可導(dǎo)致皮膚癌、肝癌、肺癌和膀胱癌等發(fā)生。地方性砷中毒包括飲水型和燃煤污染型，其中燃煤污染型地方性砷中毒（以下簡(jiǎn)稱燃煤型砷中毒）是我國(guó)特有病型，僅發(fā)現(xiàn)于我國(guó)貴州、陜西兩省。砷對(duì)機(jī)體作用復(fù)雜，其致病或致癌機(jī)制不清是砷中毒預(yù)防和控制的主要難題。
　　已證實(shí)砷暴露可導(dǎo)致DNA、染色體損傷，同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)砷可抑制一些DNA修復(fù)酶表達(dá)，

2、且砷暴露者存在DNA修復(fù)缺陷，提示DNA損傷及DNA損傷修復(fù)受抑均可能在砷毒作用機(jī)制中起重要作用。核苷酸切除修復(fù)（NER）系統(tǒng)是修復(fù)環(huán)境中理化因素所致DNA損傷的一個(gè)重要修復(fù)系統(tǒng)，受損DNA的“識(shí)別”、“解旋”和“切除”是NER修復(fù)過程中的三個(gè)限速步驟，控制核苷酸切除修復(fù)進(jìn)程，XPC、XPD和ERCC1蛋白分別參與此三個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，發(fā)揮識(shí)別受損DNA、使受損DNA雙鏈發(fā)生解旋以及切除受損 DNA的作用。有研究表明，核苷酸切除修復(fù)基因變異或

3、表達(dá)異常與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，但其機(jī)制并不清楚。
　　目前研究認(rèn)為，除遺傳學(xué)外，尚存在表觀遺傳學(xué)這一重要的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。DNA甲基化是最重要的表觀遺傳模式之一，特定基因高甲基化與基因表達(dá)沉默密切相關(guān)。無機(jī)砷在生物體內(nèi)的甲基化代謝與DNA甲基化過程極為相似，可能存在對(duì)甲基供體S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的競(jìng)爭(zhēng)，并因此干擾機(jī)體DNA甲基化模式。
　　本研究以該省燃煤型砷中毒人群及體外培養(yǎng) HaCaT細(xì)胞為研究對(duì)象，采用重亞

4、硫酸鹽測(cè)序-定量甲基化特異性 PCR法檢測(cè)砷中毒患者外周血淋巴細(xì)胞、皮膚組織中XPC、XPD基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)及ERCC1基因第2外顯子區(qū)、轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)－4901~－4671區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)砷中毒患者外周血淋巴細(xì)胞中XPC、XPD和ERCC1基因 mRNA表達(dá)；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)砷中毒患者皮膚組織中XPC、XPD和ERCC1蛋白表達(dá)。采用四噻唑藍(lán)法測(cè)定亞砷酸鈉處理HaCaT細(xì)胞中細(xì)胞代謝活力，單細(xì)

5、胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞DNA損傷效應(yīng)；重亞硫酸鹽測(cè)序法和重亞硫酸鹽測(cè)序-定量甲基化特異性PCR法檢測(cè)XPC、XPD基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)及ERCC1基因第2外顯子區(qū)、轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)－4901~－4671區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)XPC、XPD和ERCC1基因mRNA表達(dá)；免疫印跡法檢測(cè)XPC、XPD和ERCC1蛋白表達(dá)。同時(shí)用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-脫氧雜氮胞苷（5-AZA-dC）對(duì)亞砷酸鈉處理HaCaT細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)

6、，用上述方法分別檢測(cè)XPD基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)、XPD基因mRNA及蛋白表達(dá)水平。
　　人群研究發(fā)現(xiàn)：砷中毒患者外周血淋巴細(xì)胞和皮膚組織中XPD基因啟動(dòng)子區(qū)、ERCC1基因第2外顯子區(qū)存在高甲基化，且在外周血淋巴細(xì)胞和皮膚組織中兩者高甲基化存在一致性；XPD、ERCC1基因mRNA及蛋白表達(dá)下降，且蛋白表達(dá)下降與其高甲基化有關(guān)。體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：NaAsO2處理細(xì)胞XPD基因啟動(dòng)子區(qū)存在高甲基化，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系；X

7、PC和XPD基因mRNA及蛋白表達(dá)下降，且XPD基因mRNA及蛋白表達(dá)下降與其啟動(dòng)子區(qū)高甲基化有關(guān)。體外干預(yù)實(shí)驗(yàn)研究觀察到5-AZA-dC可逆轉(zhuǎn)NaAsO2所致的XPD基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化，且上調(diào)XPD mRNA和蛋白表達(dá)受抑水平。
　　全文結(jié)論：
　　1、人群和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，砷通過導(dǎo)致XPD基因高甲基化改變，繼而引起XPD基因mRNA及蛋白表達(dá)受抑，其可能通過影響XPD蛋白對(duì)受損DNA的解旋，繼發(fā)性抑制DNA修復(fù)，

8、促進(jìn)砷中毒乃至皮膚癌的發(fā)生發(fā)展。
　　2、人群研究發(fā)現(xiàn)：①燃煤砷污染致人體ERCC1基因高甲基化，是引起其mRNA及蛋白表達(dá)降低的原因之一，ERCC1蛋白參與受損DNA的“切除”步驟可能是砷毒作用主要環(huán)節(jié)；②砷中毒患者外周血淋巴細(xì)胞和皮膚組織中XPD基因啟動(dòng)子區(qū)、ERCC1基因第2外顯子區(qū)高甲基化存在一致性，為兩者成為監(jiān)測(cè)砷中毒發(fā)生發(fā)展的早期生物學(xué)標(biāo)志提供了重要線索。
　　3、體外干預(yù)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5