hsBAFF通過Ca2+-CaMKII依賴抑制PP2A激活Erk1-2導致B細胞增殖機理研究.pdf

1、本研究運用RAN干擾、Western bloting、細胞培養(yǎng)、流式細胞儀等細胞學分子生物學技術，通過在體、離體實驗，研究了PP2A活性與Erk1/2信號轉導在hsBAFF激活B淋巴細胞增殖中的作用;通過使用鈣離子螯合劑或CaMKⅡ抑制劑，進一步探討了hsBAFF上調B淋巴細胞[Ca2+]i與PP2A活性表現(xiàn)以及Erk1/2激活的關系，本研究旨在為理解BAFF調節(jié)體液免疫機制和相關疾病的防治提供理論基礎和科學依據(jù)。結果如下:
　　

2、1、hsBAFF通過抑制PP2A激活Erk1/2促進B細胞增殖
　　在體小鼠實驗，選取40只ICR健康小鼠，雌雄各半，隨機分成對照組和4個不同劑量hsBAFF處理組，每組8只。處理組每日按照含hsBAFF0.1、0.5、1和2 mg/kg體重的PBS溶液進行腹腔注射，對照組注射同等劑量的PBS溶液。在注射8天后，用抗CD19磁珠分離純化脾臟B淋巴細胞。離體細胞實驗，分別接種6、24或96孔培養(yǎng)板的Raji細胞和/或分離純化原代B淋

3、巴細胞，用0-5μg/mlhsBAFF處理12或48 h、或用2.5μg/ml hsBAFF處理0-24 h。以上實驗分析細胞增殖活性、PP2A和Erk1/2蛋白表達變化。采用Ad-MKK1-R4F、Ad-MKK-K97M感染Raji細胞分別持續(xù)激活或鈍化MKK活性，或用Ad-PP2A-wt感染Raji細胞過表達PP2A，論證PP2A-Erk1/2信號級聯(lián)在hsBAFF促進B細胞增殖中的作用。結果顯示: hsBAFF注射小鼠8天后，脾臟

4、B淋巴細胞增殖活性呈現(xiàn)劑量依賴性升高，并且可見PP2A去甲基化和磷酸化及Erk1/2磷酸化也呈hsBAFF劑量依賴增加。離體實驗顯示，hsBAFF促進B細胞增殖與其抑制PP2A活性導致Erk1/2磷酸化增加有密切關系。這被持續(xù)激活MKK1強化hsBAFF誘導Erk1/2磷酸化和B細胞增殖作用，而鈍化MKK1使得hsBAFF誘導Erk1/2磷酸化和增殖減弱，以及PP2A過表達部分地阻止hsBAFF激活Erk1/2和B細胞增殖證據(jù)支持。提示

5、:hsBAFF通過抑制PP2A激活Erk1/2促進B細胞增殖。
　　2、hsBAFF通過Ca2+-CaMKⅡ依賴抑制PP2A誘導Erk1/2激活和B細胞增殖
　　將培養(yǎng)的Raji細胞接種于6或24孔培養(yǎng)板，在1和2.5μg/ml hsBAFF單獨作用及與抑制劑聯(lián)合作用12h或48 h，各種抑制劑BAPTA/AM、EGTA、2-APB或KN93在加hsBAFF前預處理1h。Western blot檢測PP2A活性和Erk1/2

6、激活狀態(tài)、細胞計數(shù)評估B細胞增殖表現(xiàn)。結果顯示:BAPTA/AM、EGTA或2-APB削弱hsBAFF抑制PP2A活性，進而降低Erk1/2磷酸化和B細胞增殖，表明hsBAFF抑制PP2A激活Erk1/2和B細胞增殖是Ca2+依賴的。CaMKⅡ抑制劑KN93通過削弱hsBAFF誘導PP2A活性抑制明顯阻止Erk1/2磷酸化和B細胞增殖，表明hsBAFF刺激CaMKⅡ抑制PP2A激活Erk1/2和B細胞增殖。本研究提示:hsBAFF通過C