黑尾葉蟬NcPGRP基因克隆及RDV感染對其轉錄水平的影響.pdf

1、黑尾葉蟬Nephotettix cincticeps(Uhler)屬于半翅目葉蟬科，是我國水稻上重要害蟲之一。黑尾葉蟬除刺吸取食水稻汁液為害外，還能傳播水稻矮縮病毒(rice dwarf virus, RDV)，對水稻造成了嚴重危害。昆蟲先天免疫是昆蟲防御病原微生物的首道防線，而肽聚糖識別蛋白(peptidoglycan recognition protein，PGRP)則是昆蟲免疫系統(tǒng)中的重要免疫識別蛋白，在昆蟲產生抗菌肽等免疫物質的

2、過程中起到重要調控作用。黑尾葉蟬作為RDV的介體昆蟲，目前關于RDV對黑尾葉蟬免疫能力影響的相關報道較少。本文通過轉錄組分析，得到數個黑尾葉蟬PGRPs基因，篩選出其中轉錄水平被RDV所抑制的PGRPs，通過基因克隆及原核表達研究NcPGRP分子特性和蛋白特性，利用定量PCR和RNAi技術研究NcPGRP在黑尾葉蟬免疫反應中的功能。主要研究內容如下:
　　1.以各常見昆蟲PGRP基因作為參考序列，通過本地blast從黑尾葉蟬轉錄組

3、數據中篩選到12個E值(E-Value)較高的PGRPs基因。利用定量PCR檢測感染RDV黑尾葉蟬體內各PGRPs的表達量，篩選出3個轉錄水平會受到RDV抑制的PGRPs基因。
　　2.NcPGRP基因克隆結果顯示，NcPGRP基因開放閱讀框大小為552 bp，預測蛋白大小約19.9 kDa，等電點(pI)為7.29，N端無信號肽，15～34位氨基酸為跨膜結構域，含3個鋅離子結合/酰胺酶催化位點，1個二氨基庚二酸型(Dap型)肽聚

4、糖識別位點。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，NcPGRP與其他昆蟲親緣關系較遠。組織分布研究表明，NcPGRP基因的mRNA在各組織中均有表達，且頭部表達量最高。
　　3.利用黑尾葉蟬NcPGRP基因序列構建重組表達載體，并在大腸桿菌Rosetta菌株中進行誘導表達。結果顯示NcPGRP蛋白大小約20 kDa。利用其氨基酸序列制作多肽抗體。Western blot檢測結果表明黑尾葉蟬體內NcPGRP蛋白的表達量很低。
　　4.利用顯微注射

5、技術對黑尾葉蟬進行病原細菌感染，定量PCR結果顯示，NcPGRP的轉錄水平在大腸桿菌Escherichia coli DH5。及藤黃微球菌Micrococcus luteus感染葉蟬后顯著上調，且兩種病原細菌上調NcPGRP轉錄水平的能力沒有顯著差異。成蟲羽化后NcPGRP轉錄水平逐漸上升，在羽化后第10天達到峰值，后開始逐漸下降。黑尾葉蟬在取食感染水稻普通矮縮病毒RDV的水稻后，NcPGRP轉錄水平受抑制。使用dsPGRP對黑尾葉蟬進