人骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定.pdf

1、目的:建立人骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）體外分離、培養(yǎng)及擴增的方法，觀察MSCs體外培養(yǎng)增殖的生物學特性，并應(yīng)用流式細胞術(shù)，檢測細胞表型，分析鑒定MSCs的純度。
　　方法:
　　本論文采用的主要研究方法如下:
　　(1)無菌條件下抽取骨髓液5mL，用等體積PBS稀釋混勻，室溫下1500rpm離心10分鐘，棄去脂肪層，將稀釋骨髓液沿離心管壁緩慢加到等體積Ficoll分離液(1.077g/mL)上面，室溫2500rpm離

2、心30分鐘，吸取界面白膜狀層的單個核細胞。用PBS混懸后，室溫1500rpm離心10分鐘，棄上清并重復洗滌2次。用含10％ FBS的LG-DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，調(diào)整細胞密度為2×105/mL，接種于底面積為25cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。3天后首次換液，棄去懸浮細胞后，每2～3天換液一次。每日鏡下觀察細胞形態(tài)及生長變化，待細胞生長達80％～90％融合時，用0.25％胰蛋白酶-0.02％ EDTA(1∶1，

3、V/V)進行消化，再按1∶2比例進行傳代培養(yǎng)，共傳代三次。
　　(2) MSCs的生長曲線測定:取P3細胞，按5×104/mL濃度接種于24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，每天取3孔，計算平均值，連續(xù)培養(yǎng)8天，采用血球計數(shù)板計數(shù)法，繪制生長曲線。
　　(3)貼壁率測定:取P3細胞，按5×104/mL濃度接種于25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)，每2小時取2瓶，消化計數(shù)，計算貼壁率，繪制貼壁率曲線。
　　(4) MSCs的表型鑒定:取P3細胞，將細胞

4、消化吹打制成單細胞懸液，1500rpm離心5分鐘，棄去上清液，用PBS重復洗滌后，調(diào)整細胞濃度為5×106/mL，各取細胞懸液100μL，分別滴加熒光標記抗人CD34-PE、CD44-FITC、CD29-PEcy5.5、CD105-FITC、HLA-DR-PE抗體10μL，4℃避光孵育30分鐘，PBS洗滌后應(yīng)用流式細胞儀進行檢測，確定MSCs的表面標志物的表達情況。
　　結(jié)果:
　　(1) MSCs屬于骨髓中的單個核細胞，采

5、用密度梯度離心法與貼壁篩選法相結(jié)合可以有效分離、純化人骨髓MSCs。細胞形態(tài)觀察:細胞初接種入培養(yǎng)瓶時為圓形的單個核細胞，大小不一，與周圍的血細胞相互混雜。培養(yǎng)24小時后，細胞開始出現(xiàn)貼壁，48～72小時細胞貼壁逐漸增多，72小時首次換液后，可見少量分散的短梭形及不規(guī)則多角形的初始貼壁細胞。第4～8天細胞生長快，呈集落樣生長，可見有粗大的突起伸出，細胞形態(tài)呈梭形。第10-12天后細胞克隆進一步擴大，呈大的長梭形，培養(yǎng)至第14～16天時貼

6、壁細胞可達80％～90％融合，大量貼壁細胞呈長梭狀成纖維細胞樣形態(tài)并列或呈漩渦狀排列。傳代細胞剛接種時為圓形，較大，24小時內(nèi)能完全貼壁，伸展呈梭形，增殖迅速，5-7天細胞融合可達90％。細胞形態(tài)均勻，與成纖維細胞形態(tài)相似，大部分呈長梭狀，排列規(guī)則。
　　(2) MSCs的生長曲線分析:細胞生長曲線呈S形，原代細胞生長比傳代細胞慢。原代細胞接種后第0～3天為生長潛伏期;第4～12天為對數(shù)生長期;此后逐漸減緩，進入平臺期。傳代細胞培

7、養(yǎng)時第1～2天細胞生長處于潛伏期，第3天開始細胞生長較快，至第6～7天達頂點，后進入平臺期。
　　(3)測定貼壁率:傳代后的細胞貼壁較快，4小時貼壁細胞超過50％，而12小時左右超過90％的細胞已經(jīng)貼壁。
　　(4)流式細胞儀檢測P3細胞顯示:CD29、CD44、CD105的陽性表達率分別為99.82％、99.82％、97.38％，對CD34、HLA-DR的陽性表達率分別為4.94％、1.87％。
　　結(jié)論: