血流動力學對動脈粥樣硬化疾病及血管發(fā)育影響的機制研究.pdf

1、從建立血液循環(huán)開始，血管系統(tǒng)就是一個以心臟為中心的力學系統(tǒng)，血流動力學因素在血管生理病理過程中的作用尤為重要。雖然過去的很多年中對血流動力學因素參與血管疾病以及血管發(fā)育生理病理過程有一定程度的研究和理解，但是由于研究方法手段和模式動物的限制，血流動力學對血管疾病和血管發(fā)育過程影響的在體研究還非常缺乏，血流動力學參與調(diào)節(jié)血管病理生理過程的作用機制以及下游參與調(diào)控的信號通路等諸多方面的還知之甚少。
　　動脈粥樣硬化(atheroscl

2、erosis, AS)好發(fā)于動脈的彎曲、分叉及狹窄部位，這些AS好發(fā)的區(qū)域存在共同的血流動力學特點，血流流場紊亂，會形成漩渦和旋擰流。局部的血流動力學改變可能導致了AS局炤性的產(chǎn)生。基于以上理論，本論文第一部分研究主要目的就是闡明血流動力學的改變對AS發(fā)生的局灶性的影響。
　　血管的發(fā)育在很大程度上是由遺傳控制，但是近年的研究發(fā)現(xiàn)血管的發(fā)育不僅僅是一個遺傳因素控制的過程，力學因素也是心血管系統(tǒng)發(fā)育所必需的。但到底哪些力學因素對血管

3、發(fā)育的過程產(chǎn)生如此重要的影響并沒有深入的研究，并且到目前為止血流動力學對血管發(fā)育影響的力學信號通路也沒有完全闡明，血管內(nèi)皮細胞應對血流機械性質(zhì)改變的分子機制，至今尚不完全清楚?；谝陨弦恍┥形赐耆鉀Q的科學問題，本論文第二部分主要工作是研究血流動力學改變對血管發(fā)育的影響極其分子機制，探討內(nèi)皮細胞細胞收縮在力學機械信號傳導中的作用機制。
　　本論文主要研究內(nèi)容和結(jié)論如下：
　　①在胚胎透明的Flk1: GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚中注射

4、紅色熒光標記的低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL），通過激光共聚焦顯微鏡在體觀察 LDL在血管管腔中的分布，結(jié)果顯示血管系統(tǒng)中從血管壁面到血管中軸位置LDL是呈梯度分布的，LDL在血管壁面的濃度顯著高于血管管腔中的濃度，表明血液循環(huán)系統(tǒng)中存在脂質(zhì)濃度極化現(xiàn)象。并且我們還發(fā)現(xiàn)在血管分叉處的壁面LDL濃度顯著高于血管平直段壁面LDL濃度，猜測這個現(xiàn)象很可能是由于局部血流擾動產(chǎn)生的。隨后采取數(shù)值模擬和實測的方

5、法模擬狹窄部位的流場，結(jié)果顯示在局部狹窄處血液流場紊亂、有二次流和漩渦的形成。同時利用兔子作為模式生物，通過血管外周套環(huán)的方法建立在體的頸總動脈狹窄模型，分別給兔子飼喂高脂飼料和正常飼料，研究結(jié)果顯示在套環(huán)狹窄組才會有動脈粥樣硬化斑塊和病變的發(fā)生，在高脂組病變加劇。而在非手術(shù)組，不管是正常飼料還是高脂組都沒有病變的產(chǎn)生。這說明動脈粥樣硬化疾病局炤性的產(chǎn)生及其病變發(fā)生發(fā)展過程，局部血流動力學的改變是關(guān)鍵因素。
　?、诮柚毎t色熒

6、光標記同時血管內(nèi)皮細胞綠色熒光標記的雙轉(zhuǎn)基因斑馬魚作為模式生物，通過激光共聚焦顯微鏡在體觀察、全胚原位雜交以及熒光定量PCR等手段，研究血流動力學力學改變對血管發(fā)育的影響。研究結(jié)果顯示在斑馬魚血管生成過程中，血流減小會導致斑馬魚血管發(fā)育畸形以及血管內(nèi)皮特異標記基因 flk1、動脈特異標記基因ephrinB2和靜脈特異標記基因 flt4的表達降低，并且flt4表達降低更加顯著，說明血流動力學改變會影響斑馬魚血管生成過程，血流對靜脈的發(fā)育影

7、響更大。
　?、弁ㄟ^MATLAB和Image J軟件對血液流動視頻進行分析，我們發(fā)現(xiàn)在血流動力學調(diào)節(jié)血管發(fā)育過程中血流量、血液流速以及壁面剪切力發(fā)生顯著的改變，但是心率卻沒有顯著性的變化。然后我們對不同血流大小情況下各個力學因素與flk1相對表達量的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示隨著血流量、血液流速以及壁面剪切力的減少，flk1的相對表達量也是減少。血流量和血液流速與 flk1的相對表達量不是呈線性關(guān)系，而血流剪切力與 flk1的相對

8、表達量基本是呈線性關(guān)系的。說明這三種血流動力學因素都是參與了力學調(diào)節(jié)血管發(fā)育過程的。
　?、芡ㄟ^原位雜交和定量PCR實驗研究，我們發(fā)現(xiàn)血流減小會導致斑馬魚中轉(zhuǎn)錄因子klf2a以及enos類似物nos2b的基因表達降低。于是接下來我們研究了klf2a和nos2b這兩個力學響應因子參與力學調(diào)節(jié)血管發(fā)育這個過程的分子機理，單獨注射klf2a-MO會導致血管發(fā)育畸形和nos2b表達的下調(diào)，并且這個過程是可以通過共注射klf2a-mRNA進

9、行回救。說明klf2a參與血流動力學調(diào)節(jié)的血管發(fā)育過程，并且暗示nos2b也可能參與了該過程。
　?、萃ㄟ^平板流動腔設備人臍靜脈內(nèi)皮細胞體外加載剪切應力，結(jié)果顯示剪切力可以促進細胞收縮并且上調(diào)klf2和enos基因和蛋白表達。利用三種特異性的細胞收縮和松弛的藥物分別處理細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞的收縮和松弛狀態(tài)可以調(diào)節(jié)klf2和enos基因和蛋白的表達，并且這個過程是通過F-actin聚合/解聚和myosin II來實現(xiàn)的。
　　綜

10、上所述，我們的研究結(jié)果第一次在體的觀察和證實了血液循環(huán)系統(tǒng)中脂質(zhì)濃度極化現(xiàn)象的存在，闡明了局部血流動力學改變導致AS局灶性的產(chǎn)生并且促進了動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展。并且我們的研究工作第一次在體的并且詳細的分析了在血流動力學對血管生成影響過程中各個血流動力學因素與血管發(fā)育的關(guān)系，同時發(fā)現(xiàn)了klf2a作為重要的力學響應因子參與血流動力學調(diào)節(jié)血管發(fā)育的過程。最后，本文的研究工作還為剪切力調(diào)控相關(guān)響應因子的表達提供新的信號通路：剪切力通過調(diào)節(jié)F-a