自體骨髓間充質(zhì)干細胞和同種異體軟骨細胞共培養(yǎng)復合脫細胞真皮基質(zhì)修復關節(jié)軟骨全層缺損的實驗研究.pdf

1、目的：1 探討自體骨髓間充質(zhì)干細胞(bonemarrow-derived mesenchymal stem.cells，BMSCs)和同種異體軟骨細胞共培養(yǎng)的可行性，為擴大和優(yōu)化軟骨組織工程種子細胞源提供實驗依據(jù)。2 共培養(yǎng)細胞與脫細胞真皮基質(zhì)(acellular derma matrix，ADM)復合修復兔膝關節(jié)軟骨全層缺損，對修復組織進行評分，評價修復效果，為臨床應用組織工程學方法修復關節(jié)軟骨缺損提供理論依據(jù)和奠定實驗基礎。

2、 方法：選用健康的4-6月齡新西蘭兔36只，2-4周齡幼兔12只。使用酶消化分離法獲得軟骨細胞，使用密度梯度離心和貼壁篩選的方法獲得BMSCs。取細胞濃度為3×105/ml的第二代BMSCs和軟骨細胞，隨機分為三組，A組：將BMSCs和軟骨細胞按2:1比例混勻，作為共培養(yǎng)組(最終濃度為3×105/ml)，B組為濃度為3×105/ml的單獨軟骨細胞組，C組為低濃度單純軟骨細胞組(濃度為1×105/ml，與A組中軟骨細胞濃度相同)，將三組進

3、行比較，繪制細胞生長曲線并測定消化液中糖胺多糖(glycosaminoglycan，GAG)含量。用小牛真皮制備ADM作為細胞載體，將A組共培養(yǎng)細胞與ADM體外復合培養(yǎng)3天后，移植于兔膝關節(jié)軟骨全層缺損處。將36只新西蘭兔隨機分為共培養(yǎng)細胞/ADM實驗組、ADM對照組和空白對照組。實驗組髁間窩軟骨缺損處植入共培養(yǎng)細胞/ADM，ADM對照組單純植入膠原膜，空白對照組不作任何植入，分別于術后4周、8周和12周每組各處死4只動物，取材對修復組

4、織進行大體、組織學及免疫組化染色觀察，根據(jù)關節(jié)軟骨大體及組織學評分標準對修復組織進行評分，數(shù)據(jù)輸入SPSS 13.0軟件，用隨機分組的SNK-q法進行統(tǒng)計分析，比較各組的評分差異是否具有統(tǒng)計學意義。 結果：A組細胞平均群體倍增時間為3天，B組為7天，C組為8天，A組共培養(yǎng)細胞增殖比B組和C組明顯增快，有顯著性差異(p<0.05)；三組細胞中GAG含量A組明顯多于B、C兩組，有顯著性差異(p<0.05)。術后12周共培養(yǎng)細胞/AD

5、M實驗組修復組織呈透明軟骨樣，表面光滑平坦，與周圍軟骨及軟骨下骨整合良好，而ADM對照組和空白對照組為纖維性修復和無修復。修復組織大體評分共培養(yǎng)細胞/ADM實驗組明顯優(yōu)于ADM對照組和空白對照組(P<0.05)，ADM對照組優(yōu)于空白對照組(P<0.05)；組織學評分顯示共培養(yǎng)細胞/ADM實驗組明顯優(yōu)于ADM對照組和空白對照組(P<0.05)，ADM對照組和空白組無顯著性差異(P>0.05)。免疫組化染色顯示共培養(yǎng)細胞/ADM實驗組修復區(qū)

6、的軟骨細胞呈柱狀排列，富含Ⅱ型膠原，與周圍軟骨及軟骨下骨結合良好。 結論：自體BMSCs與同種異體軟骨細胞為種子細胞共培養(yǎng)，BMSCs能促進軟骨細胞的增殖和細胞外基質(zhì)合成，縮短軟骨細胞培養(yǎng)時間和減少傳代次數(shù)，同時軟骨細胞可促進BMSCs向軟骨細胞的定向轉化，可節(jié)省大量的軟骨細胞： 自體BMSCs與同種異體軟骨細胞共培養(yǎng)未見明顯排異反應；ADM適合共培養(yǎng)細胞的黏附和增殖，是軟骨組織工程理想的支架材料；ADM接種共培養(yǎng)細胞植