間充質干細胞與骨腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系研究.pdf

1、目的: 本研究的總體目標是探討間充質干細胞(MSC)與骨腫瘤生長的關系，為骨腫瘤的治療尋找新的靶點和治療策略。具體目標包括： 1.比較骨腫瘤患者與健康對照者外周血中具備MSC表型的細胞比例和血漿中細胞因子含量的差異。 2.在體外分析MSC與骨肉瘤細胞之間的相互作用及其分子機制。 3.探討MSC對體內骨肉瘤生長的影響以及MSC對骨肉瘤的趨向性。 方法: 1.通過CD105、CD34，CD45

2、表面標志的流式細胞術檢測，分析骨的肉瘤患者以及健康對照者外周血中MSC樣細胞的數(shù)量，分離培養(yǎng)外周血中的單核細胞，同時獲取分離的血漿進行細胞因子檢測。 2.將MSC與SaOS-2骨肉瘤細胞分別用對方的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)，用MTT法檢測細胞的增殖。并分析二者的條件培養(yǎng)基以及普通的培養(yǎng)基對MSC成骨及成脂分化的影響。用抗體芯片法檢測條件培養(yǎng)基內細胞因子的含量。 3.將SaOS-2骨肉瘤細胞、MSC或二者混合后一同接種于裸小鼠脛骨近

3、端髓腔內，比較各組動物的體重增加值，細胞注射側后肢以及腫瘤體積大小，各組的腫瘤形成率以及血漿堿性磷酸酶(ALP)活性的差異。將綠色熒光蛋白(GFP)標記的MSC通過尾靜脈注入荷瘤裸鼠體內，了解MSC在鼠體內的分布。 結果: 1.流式細胞術的檢測結果表明骨的肉瘤患者外周血中具有MSC表型的細胞(CD34-，CD45-，CD105+)數(shù)量增加，為對照組的9.12倍，具有統(tǒng)計學差異(P=0.04)。血漿細胞因子的ELISA檢測

4、結果顯示骨的肉瘤患者的外周血血漿中的肝細胞生長因子(HGF)濃度顯著高于對照組(p-0.038)；而血管內皮生長因子(VEGF)、瘦素以及基質細胞衍生因子-1(SDF-1)的濃度無顯著性差異。 2.MTT檢測顯示MSC與骨肉瘤細胞的條件培養(yǎng)基可以促進彼此的增殖。骨肉瘤細胞的條件培養(yǎng)基可以抑制MSC的成骨及成脂分化。此外，MSC與骨肉瘤細胞對彼此的條件培養(yǎng)基具有趨向性。抗體芯片結果顯示MSC與骨肉瘤細胞共培養(yǎng)時的條件培養(yǎng)基內的白細

5、胞介素-6(IL-6)與受激活調節(jié)的正常T細胞表達和分泌因子(RANTES)的濃度高于二者分別單獨培養(yǎng)時的條件培養(yǎng)基內的濃度(>2倍)。 3.細胞注射8周時，X線與病理檢查顯示單純注射MSC的動物組無腫瘤形成。單純注射骨肉瘤細胞的動物與混合注射的裸鼠均有腫瘤形成，且腫瘤形成率、肺轉移率以及腫瘤結構相似，二組的體重增加值明顯低于單純MSC注射組(p<0.05)?；旌献⑸鋭游锝M的腫瘤體積以及患肢的體積明顯大于單純骨肉瘤細胞注射組(p

6、<0.05)，血漿ALP活性顯著也高于單純骨肉瘤細胞注射組與單純MSC注射組(p分別為0.029與0.003)。此外冰凍切片檢查顯示通過尾靜脈輸入荷瘤鼠體內的MSC選擇性地分布于腫瘤組織內。 結論: 1.骨的肉瘤患者外周血內MSC樣細胞數(shù)量較正常對照者明顯增加，血漿內HGF的水平顯著升高，外周血內MSC數(shù)量的增加可能是通過這一因子介導的。 2.體外培養(yǎng)的MSC與骨肉瘤細胞存在相互作用，這種相互作用可能是通過可溶性