p38參與調節(jié)Zymosan A誘導的相關細胞因子mRNA穩(wěn)定性研究.pdf

1、目的：探討真菌多糖Zymosan A對其mRNA3’UTR含ARE的細胞因子（TNF-α、CXCL1、IL-10、IL-23a）的誘導表達，研究p38對此類細胞因子mRNA穩(wěn)定性的調節(jié)作用及機制，為真菌的致病機制與治療研究提供新思路與新靶標。
　　方法：分離純化小鼠pMΦ，分別培養(yǎng)原代pMΦ及Raw264.7細胞株，提取蛋白樣品，采用western blot方法檢測Zymosan A誘導的MAPK信號通路中p38、ERK、JNK等

2、激酶的磷酸化；用生物信息學方法分析Zymosan A誘導的細胞因子的mRNA3’UTR，尋找富含ARE可能存在mRNA轉錄后水平調控的細胞因子；采用real-time PCR方法，檢測Zymosan A誘導的mRNA3’UTR含ARE的細胞因子（TNF-α、CXCL1、IL-10、IL-23a）的表達水平，及其相關細胞因子mRNA終止轉錄后的降解程度，觀察分析mRNA穩(wěn)定性；分別用p38抑制劑（SB202190）、ERK抑制劑（PD98

3、059）、JNK抑制劑（SP600125）阻斷信號通路中的靶向蛋白激酶，real-time PCR方法檢測細胞因子（TNF-α、CXCL1、IL-10、IL-23a）mRNA穩(wěn)定性的改變；分別用p38抑制劑（SB202190）、ERK抑制劑（PD98059）、JNK抑制劑（SP600125）阻斷信號通路中的靶向蛋白激酶，提取蛋白樣品，采用western blot方法分別檢測CREB、ERK及c-Jun的磷酸化，鑒定抑制劑阻斷作用，同時檢

4、測MK2的磷酸化，確定p38對MK2的調節(jié)作用；采用體外酶活實驗，用Zymosan A處理細胞，提取蛋白樣品，加入λPP，30℃孵育5min，檢測TTP磷酸化，進一步驗證在Zymosan A誘導的細胞因子（TNF-α、CXCL1、IL-10、IL-23a）mRNA穩(wěn)定性調節(jié)中，p38通過對MK2及TTP的磷酸化發(fā)揮調節(jié)作用。
　　結果：Zymosan A能激活MAPK信號通路，磷酸化p38、ERK、JNK等蛋白激酶及RNA結合蛋白

5、TTP，Zymosan A激活p38、ERK、JNK等蛋白激酶的最佳濃度為100μg/ml，同時，該濃度能有效誘導TNF-α、CXCL1、IL-10及IL-23a等細胞因子的表達。生物信息學分析表明上述細胞因子mRNA3’UTR富含ARE。Zymosan A誘導的ARE-細胞因子，在終止轉錄4h后，mRNA降解為50％-60%，mRNA穩(wěn)定性良好。p38抑制劑（SB202190）處理后，結果顯示p38抑制劑能夠有效的抑制其下游MK2及T

6、TP的磷酸化，并使TNF-α、CXCL1、IL-10及IL-23a的mRNA含量在轉錄后明顯減少，降解為10%左右，表明其mRNA穩(wěn)定性降低。體外酶活實驗檢測發(fā)現(xiàn)加入磷酸酯酶后，TTP磷酸化消失。ERK抑制劑（PD98059）處理后，結果顯示ERK磷酸化被明顯抑制，但TNF-α、CXCL1、IL-10及IL-23a的mRNA含量無變化，mRNA穩(wěn)定性無影響。JNK抑制劑（SP600125）處理后，結果顯示其下游轉錄因子c-Jun磷酸化被

7、明顯抑制，但TNF-α、CXCL1、IL-10及IL-23a的mRNA含量無變化，mRNA穩(wěn)定性無影響。
　　結論：
　　1．Zymosan A能激活MAPK信號通路，磷酸化p38、ERK、JNK等蛋白激酶，并誘導TNF-α、CXCL1、IL-10、IL-23a等細胞因子的大量表達。
　　2．p38能夠增強Zymosan A誘導的TNF-α、CXCL1、IL-10及IL-23a的mRNA穩(wěn)定性。其作用機制為p38通過磷