Math1誘導的哺乳動物的耳蝸再生毛細胞的形態(tài)學及功能學研究.pdf

1、目的：轉(zhuǎn)錄因子Math1誘導了終末支持細胞向新生毛細胞的轉(zhuǎn)分化。1)本實驗在描述支持細胞轉(zhuǎn)分化為新生毛細胞的形態(tài)學變化過程的同時,通過使用正常毛細胞相關特異性標記物,在形態(tài)學方面對新生毛細胞和正常毛細胞進行了比較;2)本實驗進一步闡述了在Math1的作用下支持細胞轉(zhuǎn)分化為毛細胞的轉(zhuǎn)分化機制;3)本實驗在功能學方面對新生毛細胞與發(fā)育中的正常毛細胞進行了比較,探討其是否已經(jīng)具備了正常毛細胞的功能性。
　　方法：本實驗使用了正常出生后3

2、天的新生SD大鼠耳蝸進行體外器官培養(yǎng),實驗組在培養(yǎng)的過程中通過腺病毒轉(zhuǎn)染了Math1(作用基因)和EGFP(報告基因)兩個基因(Ad5-EGFP-Math1),對照組則只轉(zhuǎn)染了EGFP(Ad5-EGFP)。首先,在轉(zhuǎn)染基因后不同的時間點對培養(yǎng)組織進行固定,通過免疫熒光染色技術標記毛細胞相關特異性蛋白來鑒定是否有新生毛細胞的產(chǎn)生,并描述了轉(zhuǎn)分化的過程;其次,在耳蝸器官培養(yǎng)過程中,通過采用了Brdu摻入法,探討了支持細胞向新生毛細胞的轉(zhuǎn)分化

3、機制;然后,通過檢測新生毛細胞是否有攝取耳毒性藥物新霉素,FM1-43的能力,來驗證是否存在毛細胞特征性的機械性門控通道;最后,我們采用PatchClamp技術,在不同的時間點對新生毛細胞的各種通道電流,動作電位以及特征性的機械門控通道電流等在不同時間變化以及相關的動力學分析,驗證Math1誘導的新生毛細胞是否已經(jīng)具備了正常毛細胞的功能。
　　結果：①實驗組在Ad5-EGFP-Math1轉(zhuǎn)染耳蝸組織后的第三天,開始在小上皮嵴區(qū)域出

4、現(xiàn)了MyosinVIIA陽性細胞,大上皮嵴區(qū)域則在轉(zhuǎn)染五天后出現(xiàn)MyosinVIIA陽性細胞;鈣緩沖蛋白,如Calbindin,Calmodulin,Calretinin和PMCA2作為毛細胞的相關特異性標記物,也能在異位新生毛細胞上表達;Phlloidin的染色展示了新生毛細胞頂部的簇狀靜纖毛樣結構;在對照組的耳蝸的大、小上皮嵴區(qū)域則未出現(xiàn)這些現(xiàn)象;②Brdu摻入實驗表明,支持細胞向新生毛細胞的轉(zhuǎn)分化過程為直接轉(zhuǎn)分化,不依賴于支持細胞

5、的增殖;另外,Math1的表達水平是誘導毛細胞分化的關鍵因素;③1mM的耳毒性藥物新霉素能夠引起異位新生毛細胞的死亡;從Math1轉(zhuǎn)染后5天,部分新生毛細胞開始有能力對FM1-43的攝取,間接說明毛細胞能通過機械門控通道攝取耳毒性藥物及FM1-43;④Math1轉(zhuǎn)染后的2天,新生毛細胞開始表達鈉電流,到第5天電流密度達最大,然后逐漸減小;對照組的支持細胞不表達鈉電流;⑤Math1轉(zhuǎn)染后三天,新生毛細胞開始表達鈣電流,電流密度隨著時間逐漸

6、增大;對照組支持細胞不表達鈣電流;⑥Math1轉(zhuǎn)染后五天,新生毛細胞表達為快速失活的延遲性鉀整流,然后,表現(xiàn)為持續(xù)性基本不失活的延遲性鉀整流,且電流密度逐漸增大;而對照組的支持細胞僅表達持續(xù)不失活的幅度很小的延遲性鉀整流;⑦Math1轉(zhuǎn)染后五天,新生毛細胞表達了典型的HCN電流,且隨著時間電流密度逐漸減小,然后消失;⑧大多數(shù)的新生毛細胞上能記錄到誘發(fā)的動作電位,極少數(shù)的能記錄到自發(fā)的動作電位:⑨Math1轉(zhuǎn)染后7天,我們記錄到了新生毛細

7、胞的機械門控通道電流。
　　結論：①利用了腺病毒轉(zhuǎn)基因方式成功的建立了新生大鼠耳蝸體外培養(yǎng)在Math1誘導下產(chǎn)生異位新生毛細胞的模型;②新生毛細胞已經(jīng)具備正常毛細胞樣的形態(tài),并且表達許多相同的特異性相關蛋白;③支持細胞轉(zhuǎn)分化為毛細胞的機制為直接轉(zhuǎn)分化,無需增殖后再轉(zhuǎn)分化;④新生毛細胞有能力攝取耳毒性藥物新霉素,FM1-43,間接表明機械門控通道在新生毛細胞纖毛上的存在;⑤機械門控通道電流的出現(xiàn),在功能上標志了再生的毛細胞已經(jīng)具備了