NF-κB及其抑制物Ⅰ-κB與大腸癌侵襲和轉移的關系研究.pdf

1、目的：大腸癌是我國常見的消化道惡性腫瘤之一，惡性程度較高，發(fā)病率有逐年上升的趨勢。盡管治療手段有了很大的進步，但五年生存率仍然較低。腫瘤的侵襲和轉移是患者死亡的主要原因之一，因而，針對大腸癌侵襲和轉移機制的研究已經成為熱點。大腸癌的生物學行為復雜多變，預后影響因素諸多，發(fā)病機制不十分清楚。隨著分子生物學和免疫學的發(fā)展，對大腸腫瘤的生物學行為、預后因素以及發(fā)病機制已經從分子水平有了新的認識。大量研究顯示，核轉錄因子кB(Nuclear t

2、ranscription factor kappa B，NFкB)在大腸癌的發(fā)生和轉移等過程中發(fā)揮了較重要的作用，可能通過調控細胞的增殖、分化、凋亡及惡性轉化影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。核轉錄因子(NF-кB)是一種分布和作用均十分廣泛的真核細胞轉錄因子．它只有與其抑制因子I-кB(Inhibitor kappa B)解離后方能進入胞核，與靶基因上的KB序列特異結合，上調這些靶基因的表達，進而導致癌癥的發(fā)生。國外研究也表明多種腫瘤組織中存在NF

3、-к3的高表達和高活性現(xiàn)象。體內還存在天然的核因子KB的抑制物I-кB，可以抑制所有NF-кB的活性，影響腫瘤的侵襲和轉移等過程。I-кB是一類NF-кB的抑制蛋白，通過非共價結合，I-кB掩蓋NF-кB的核定位序列(NLS)而阻止NF-кB的核轉位。一旦受到信號分子的刺激，NF-кB就從I-кB中釋放出來，進入細胞核中。I-кB可以抑制NF-кB的活性，影響腫瘤的侵襲和轉移等過程。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)，大腸癌組織中含有較多的NF-кB.

4、然而，目前對于大腸癌中NF-кB與大腸癌的侵襲和轉移的關系的研究較少。本研究采用Western blot分析和免疫組化以及流式細胞學三種方法對大腸癌患者手術切除標本中NF-кB與I-кB的表達情況進行了研究，探討NF-кB和I-кB在大腸癌中的表達特點、相互關系以及與大腸癌進展的相關性，試圖為大腸癌的臨床治療以及判斷預后提供有價值的參考指標。 方法： 1 標本：選取河北醫(yī)科大學第四臨床醫(yī)院外二科2005年3～7月間住院行

5、外科手術治療的大腸癌患者48例，分別取其腫瘤組織與相應正常組織，正常組織距腫瘤邊緣至少10厘米。所有標本均經術后病理證實。 2 流式細胞術測定NF-кB：將選取的組織制備成單細胞懸液，分別用兔抗人NF-кB多克隆抗體和羊抗兔FITC-IgG二抗進行熒光標記，采用Epics-XLII型流式細胞儀，對NF-кB蛋白表達進行定量分析。 3 免疫組化染色：采用ABC法，按試劑盒說明進行操作。 4 NF-кB及I-кB的W

6、estern blot分析：取150μg正常與大腸癌組織提取物蛋白樣品進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移至PVDF膜上。將印跡膜置于封閉液中封閉，隨后與一抗(兔抗人NF-кB及I-кB多克隆抗體)及二抗反應。用數碼成像分析系統(tǒng)軟件對結果進行定量分析。 結果： 1 對流式細胞結果進行分析證實，正常及大腸癌組織中均可檢測到NF-кB的表達，大腸癌組織中NF-кB明顯高于正常組織，差異具有顯著性(P<0.01)；侵及漿膜或周

7、圍軟組織的大腸癌組織中NF-к3顯著高于侵及肌層者(p<0.05)；伴淋巴結轉移的大腸癌組織中NF-кB明顯高于無淋巴結轉移者(P<0.05)；隨著腫瘤Dukes分期的進展，NF-кB的水平呈逐漸升高趨勢。 2 NF-кB的Western blot分析：大腸癌組織中NF-кB的表達量明顯高于正常組織(p<0.01)；侵及漿膜或周圍軟組織的大腸癌組織中NF.KB的表達量明顯高于侵及肌層者(P<0.01)，伴淋巴結轉移的大腸癌組織中

8、NF-кB的表達量明顯高于無淋巴結轉移者(P<0.05)。分化程度低的大腸癌組織中NF-кB的表達量明顯高于分化程度高者(P<0.01)。隨著腫瘤Dukes分期的進展，NF-кB的表達量逐漸升高。 I-кB的Western blot分析：(1)大腸癌組織中I-кB的表達量明顯低于正常組織(P<0.01.)；侵及漿膜或周圍軟組織的大腸癌組織中I-кB的表達量低于侵及肌層者，但差異無顯著性(P>0.05)；伴淋巴結轉移的大腸癌組織中

9、I-кB的表達量低于無淋巴結轉移者，差異無顯著性(P>0.05)。分化程度低的大腸癌組織中I-кB的表達量明顯低于分化程度高者(P<0.05)。隨著腫瘤Dukes分期的進展，I-кB的表達量逐漸降低。(2)大腸癌組織中磷酸化I-кB的表達量明顯高于正常組織(P<0.01)；侵及漿膜或周圍軟組織的大腸癌組織中磷酸化I-кB的表達量高于侵及肌層者，但差異無顯著性(P>0.05)；伴淋巴結轉移的大腸癌組織中磷酸化I-кB的表達量高于無淋巴結轉

10、移者，差異無顯著性(P>0.05)。隨著腫瘤Dukes分期的進展，磷酸化I-кB的表達量逐漸升高。 3 免疫組化：大腸癌組織中NF-кB的陽性染色顆粒明顯多于正常組織，大腸癌組織中I-кB的陽性顆粒明顯低于正常組織，且與腫瘤分化程度及侵襲性相關。以上結果與流式細胞和Western blot分析結果相一致。NF-кB的陽性表達顆粒主要分布在腫瘤細胞的胞漿中，細胞核也有分布。I-кB多表達于胞漿。 結論： 1 大腸癌

11、組織中NF-кB的活性和表達量明顯高于正常組織，并且隨著腫瘤侵犯深度的加深、淋巴結的轉移以及Dukes分期的進展而升高，提示NF-кB在大腸癌的侵襲和轉移過程中發(fā)揮著重要的作用。 2 大腸癌組織中I-кB的活性與表達量明顯低于正常組織。磷酸化I-кB的活性與表達量明顯高于正常組織，提示I-кB的降解和磷酸化可能有助于大腸癌的進展。大腸癌分化程度低者I-кB的表達量低于分化程度高者，提示I-кB水平可能影響大腸癌的預后。