綠僵菌新轉錄本及小泛素相關修飾基因功能的研究.pdf

1、綠僵菌在害蟲生物防治中起重要作用，也已經廣泛應用于蝗蟲等的防治。羅伯茨綠僵菌（Metarhizium robertsii，下稱綠僵菌）作為昆蟲病原真菌的模式生物，在昆蟲病原真菌的代謝調控，致病機理，遺傳調節(jié)機制和生物技術防治研究中起重大作用。多年來，國內外學者致力羅伯茨綠僵菌致病和抗逆的分子機理研究，取得了豐碩的結果;但是作為生防真菌，羅伯茨綠僵菌仍有很多的弱點，如:殺蟲速度較慢，易被環(huán)境影響等，因此，限制了綠僵菌在生產上的大規(guī)模應用。

2、
　　轉錄組測序可以得到某一種特定組織或者細胞的將近全部轉錄本和基因序列通過利用二代測序平臺，而今，也已廣泛應用于真核生物，包括綠僵菌，但羅伯茨綠僵菌的轉錄組學研究內容較少;且通過利用RNA-Seq技術，可以解決特定的生物學問題，包括可變剪切分析，優(yōu)化基因結構，新轉錄本鑒定以及發(fā)掘新基因等。
　　為此，本研究以羅伯茨綠僵菌為研究對象，首先在4個不同條件下（包括生長發(fā)育、逆境脅迫、侵染定殖以及退化），培養(yǎng)綠僵菌，提取其總RNA

3、，并完成轉錄組測序;其次，就測序所得轉錄組數據進行生物信息學分析，對預測的新轉錄本，完成功能注釋;最后，針對從注釋的新轉錄本中篩選到小泛素相關修飾基因(Small ubiquitin-related modifier,下稱SUMO)，進行基因敲除，通過對敲除突變體和野生型菌株之間的生長表型、抗逆、產孢量和毒力的比較分析SUMO的可能生物學功能。具體研究結果如下:
　　(1)轉錄組測序分析發(fā)現新轉錄本:
　　研究共獲得80，9

4、54，892條序列(reads)，經過質量過濾，得到46，674，896clean reads，利用TopHat技術，比對到綠僵菌基因組，得到28，251，957reads。為了得到新轉錄本，便比對測序所組裝的轉錄本和參考基因組中已有的轉錄本。
　　本研究中，先對測序所組裝的轉錄本和參考基因組中已有的轉錄本進行比對，再進一步地預測新轉錄本。結果發(fā)現:共有769個新轉錄本，其中77個為可編碼的新轉錄本。利用NCBI本地BLAST以及

5、檢索得到的CDS(Coding sequence)數據，針對77個可編碼的新轉錄本進行功能注釋，最后篩選出NovelTr351號新轉錄本編碼SUMO蛋白;已經有大量報道顯示:SUMO是與泛素化相類似的蛋白質翻譯后修飾的一種方式，SUMO不僅可以對轉錄因子進行負調控，也可以對其完成激活轉錄。這些或許正是對環(huán)境刺激產生的應答反應，由此可見小泛素相關修飾是一種多功能的蛋白質翻譯后修飾，更是至關重要的。它不僅能降解無用的蛋白質，而且參與轉錄調控

6、，核轉運和維持基因組完整性等細胞內活動的修飾，使機體正常運作，甚至避免某些疾病的發(fā)生。且有研究表明泛素途徑可以增強植物逆境生長能力。因此，本研究進一步選擇SUMO對其可能的生物學功能進行深入分析。
　　(2)SUMO的功能分析
　　通過基因敲除，本研究獲得了△SUMO（SUMO敲除突變株）以及cp△SUMO（△SUMO回補株）。隨后表型分析發(fā)現:與野生型菌株和回補株相對比，敲除突變株在PDA培養(yǎng)基上的菌絲生長速率和狀態(tài)以及對

7、化學物質耐受和毒力，均無差異;但是敲除突變株孢子顏色由墨綠變淺;更進一步的講，敲除突變株的產孢較為稀薄，且產孢量明顯低于野生型和回補菌株，下降了50％，這些結果表明SUMO基因對綠僵菌的產孢過程可能存在調控作用;此外，與野生型菌株和回補株相對比，敲除突變株對高溫和紫外的耐受力存在顯著差異:高溫45℃處理1h，結果發(fā)現敲除株較野生型和回補株的孢子萌發(fā)率下降35-45％;紫外100μJ/cm2照射，結果發(fā)現敲除株較野生型和回補株的孢子萌發(fā)率