耐藥基因ABCG2在食管癌中的表達及青蒿琥酯逆轉耐藥的作用研究.pdf

1、目的：食管癌（esophagealcarcinoma，EC）是最常見的消化道惡性腫瘤之一?；熓悄壳笆彻馨┚C合治療的主要方法之一，但是在化療過程中出現(xiàn)的多藥耐藥是導致臨床化療失敗的重要原因。
　　 本實驗利用了多項實驗方法檢測ABCB1及ABCG2基因、蛋白在食管癌組織、非典型增生及食管正常粘膜中的表達，觀察其是否參與食管癌發(fā)生及耐藥的形成。
　　 青蒿琥酯（artesunate，Art）是我國常用的抗瘧藥物，青蒿琥酯對

2、多種腫瘤細胞具有生長抑制作用，本課題小組以前的研究結果也提示青蒿琥酯對食管癌細胞有生長抑制作用。同時研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯抗腫瘤具有不產(chǎn)生交叉耐藥的特點，提示青蒿琥酯可能具有逆轉腫瘤耐藥的作用。
　　 為此，本實驗利用了多項實驗技術研究ABCB1及ABCG2表達與食管癌多藥耐藥的關系及青蒿琥酯逆轉食管癌耐藥作用及機制，為臨床上食管癌的化療提供一些實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.ABCB1及ABCG2在食管癌中的表

3、達及其生物學意義。
　　 2.阿霉素誘導食管癌耐藥細胞中ABCG2的表達及其意義。
　　 RT-PCR、Western-blot、FCM方法檢測Eca109、Eca109/ADM細胞中ABCG2基因及蛋白的表達情況，F(xiàn)CM檢測ABCB1蛋白表達。激光共聚焦熒光顯微鏡技術檢測Eca109/ADM細胞中ABCG2蛋白定位及表達。ADM藥物干預Eca109、Eca109/ADM細胞生長，利用FCM檢測Eca109、Eca109

4、/ADM細胞中ADM含量，從而反映細胞對藥物外排作用。Art、ADM藥物干預Eca109/ADM細胞，F(xiàn)CM檢測細胞凋亡及細胞中ABCB1、ABCG2表達。
　　 3.食管癌耐藥細胞系Eca109/ABCG2的建立及其生物學特征的研究。
　　 4.青蒿琥酯逆轉Eca109/ABCG2細胞對阿霉素耐藥作用及機制。
　　 5青蒿琥酯逆轉裸鼠種植食管癌耐藥作用研究。
　　 結果：
　　 1.ABCB1及

5、ABCG2在食管癌中的表達及其生物學意義RT-PCR及FCM結果顯示，ABCB1和ABCG2mRNA及蛋白在食管癌組織中表達均顯著高于食管正常粘膜（P<0.01），在食管正常粘膜、非典型增生、癌組織之間呈現(xiàn)逐漸增高趨勢（P<0.05）。食管癌組織中，ABCB1及ABCG2mRNA和蛋白與分化程度、浸潤深度及有無淋巴結轉移密切相關（P<0.05），與性別和年齡無明顯相關（P>0.05）。食管癌組織中ABCG2mRNA及蛋白表達與ABCB1

6、mRNA及蛋白表達無顯著相關性（rs=0.077，P=0.499；rs=-0.087，P=0.444）。
　　 IHC結果顯示：ABCB1和ABCG2陽性產(chǎn)物定位于細胞膜和胞漿，呈棕黃色顆粒狀，彌漫或散在分布。食管鱗癌組織中.ABCB1和ABCG2蛋白陽性表達率（77.50％和86.25％）明顯高于不典型增生組織（31.25％和26.25％）和正常粘膜（6.25％和3.75％）（P<0.01）。
　　 2.阿霉素誘導食管

7、癌耐藥細胞中ABCG2的表達及其意義歷時8個月，成功培養(yǎng)了耐藥細胞株Eca109/ADM，與Eca109細胞相比，Eca109/ADM細胞體積變大，形態(tài)更不規(guī)則。MTT方法檢測，阿霉素（ADM）藥物作用Eca109/ADM和Eca109細胞24h，IC50值分別為15.45±1.15，4.69±0.88，Eca109/ADM細胞耐藥系數(shù)為3.29。
　　 RT-PCR、FCM、Western-blot方法檢測到Eca109/AD

8、M細胞中ABCG2mRNA和蛋白的表達量較Eca109細胞顯著增高（O<0.05）。激光共聚焦熒光顯微鏡檢測顯示，Eca109/ADM細胞中ABCG2蛋白主要表達在細胞膜及胞漿，與Eca109細胞相比，ABCG2蛋白表達增高。FCM檢測ABCB1蛋白在Eca109/ADM細胞表達量顯著高于Eca109細胞（P<0.05）。
　　 藥物外排試驗，F(xiàn)CM檢測Eca109/ADM細胞外排阿霉素的作用強于Eca109細胞。Art與ADM

9、聯(lián)合用藥于Eca109/ADM細胞，細胞凋亡率顯著高于ADM、Art單獨應用（P<0.05）。Art作用Eca109/ADM細胞48h，細胞中ABCG2蛋白表達量顯著降低（P<0.05），ABCB1蛋白表達無顯著差異（P>0.05）。
　　 3.食管癌耐藥細胞系Eca109/ABCG2的建立及其生物學特征的研究應用脂質體轉染方法，將pCDNA3.1（+）-ABCG2重組質粒及空載體PCDNA3.1成功轉染入Eca109細胞中，并

10、應用G418成功篩選出穩(wěn)定轉染細胞，轉染PCDNA3.1-ABCG2重組質粒與空載體PCDNA3.1的陽性克隆細胞分別記為Eca109/ABCG2、Eca109/PCDNA3.1細胞。
　　 MTT方法檢測結果顯示，阿霉素作用Eca109/ABCG2、Eca109/PCDNA3.1、Eca109細胞24h的IC50值分別為18.61±3.94、4.18±0.14、4.69±0.88，Eca109/ABCG2細胞耐藥性增加，相對于

11、Eca109細胞其耐藥指數(shù)為3.97。阿霉素作用Eca109/ABCG2細胞的IC50值與Eca109細胞比較，顯著增高（P<0.01），阿霉素作用Eca109/PCDNA3.1細胞的IC50值與Eca109細胞比較無差別（P>0.05）。DNR和MIT對Eca109/ABCG2細胞IC50值也分別增加，耐藥指數(shù)分別為3.50和3.15。
　　 Eca109/ABCG2細胞藥物外排實驗結果顯示，Eca109/ABCG2細胞外排阿

12、霉素的作用較Eca109、Eca109/PCDNA3.1細胞顯著增加（P<0.01）。
　　 RT-PCR、Western-blot和FCM檢測結果顯示，Eca109/ABCG2細胞中ABCG2mRNA和蛋白表達水平較Eca109/PCDNA3.1、Eca109細胞顯著升高（P<0.05）。
　　 免疫細胞化學方法檢測結果顯示，Eca109/ABCG2細胞中ABCG2蛋白主要表達在細胞膜及胞漿，與Eca109細胞相比，A

13、BCG2蛋白表達增高。
　　 4.青蒿琥酯逆轉Eca109/ABCG2細胞對阿霉素耐藥作用及機制MTT結果顯示，Art與ADM聯(lián)合作用組與單獨用Art及ADM組相比，對Eca109/ABCG2細胞生長抑制率均顯著增高（P<0.05）。
　　 Art與ADM聯(lián)合作用組與單獨應用Art及ADM組相比，Eca109/ABCG2細胞凋亡率均顯著增高（P<0.05）。
　　 RT-PCR及FCM結果顯示，Art與ADM聯(lián)合

14、作用組與單獨用ADM組相比，Eta109/ABCG2細胞中ABCG2mRNA及蛋白表達量顯著降低（P<0.05）。
　　 5.青蒿琥酯逆轉裸鼠種植食管癌耐藥作用研究成功構建人食管癌裸鼠種植瘤模型，成瘤率達100％。相同濃度的ADM組，接種Eca109/ABCG2細胞皮下種植瘤體積和重量與接種Eca109細胞皮下種植瘤相比均顯著增高（P<0.05）。Art與ADM聯(lián)合作用組與單獨應用Art或ADM組相比，Eca109/ABCG2細

15、胞皮下種植瘤的體積及重量均顯著降低（P<0.05）。
　　 Art與ADM聯(lián)合作用組與單獨應用ADM組相比，Eca109/ABCG2細胞皮下種植瘤中ABCG2mRNA及蛋白表達量均顯著降低（P<0.05）。
　　 結論：
　　 1.在食管上皮癌變過程中，食管鱗癌組織中ABCB1及ABCG2表達明顯增高，且在食管不典型增生Ⅰ級至Ⅲ級之間呈逐漸增高趨勢，提示ABCB1和ABCG2過表達可能參與食管鱗癌發(fā)生以及耐藥性的

16、產(chǎn)生。ABCB1和ABCG2表達無相關性，提示ABCB1與ABCG2引起的耐藥可能具有不同的耐藥譜。ABCG2可能成為食管癌耐藥逆轉新的靶點。
　　 2.應用ADM持續(xù)接觸濃度遞增誘導法，成功建立食管癌耐藥細胞Eca109/ADM。食管癌耐藥細胞Eca109/ADM高表達ABCB1和ABCG2，提示ABCB1和ABCG2參與了Eca109/ADM細胞耐藥的形成。青蒿琥酯可以提高ADM對Eca109/ADM細胞的殺傷作用。青蒿琥酯

17、可以降低Eca109/ADM細胞ABCG2表達而ABCB1表達無顯著差異，提示青蒿琥酯可以降低Eca109/ADM細胞ABCG2表達，從而逆轉其耐藥。
　　 3.首次應用脂質體轉染方法建立多藥耐藥食管癌細胞株Eca109/ABCG2，目前國內(nèi)外文獻尚未見相關報道。Eca109/ABCG2細胞具有ABCG2耐藥表型，能夠穩(wěn)定表達ABCG2蛋白，是研究ABCG2生物學特征良好的多藥耐藥細胞模型。
　　 4.首次初探青蒿琥酯逆

18、轉食管癌耐藥機制，國內(nèi)外尚未見相關報道。青蒿琥酯與ADM聯(lián)合應用可以降低Eca109/ABCG2細胞中ABCG2的表達，抑制ABCG2外排藥物的作用，增加細胞內(nèi)ADM含量，提高ADM對Eca109/ABCG2細胞殺傷作用，從而逆轉Eca109/ABCG2細胞對ADM的耐藥。
　　 5.建立了食管癌耐藥細胞皮下種植瘤裸鼠模型，為研究食管癌耐藥提供理想的動物模型。青蒿琥酯與ADM聯(lián)合應用，能增強ADM在體內(nèi)抑制人食管癌耐藥細胞裸鼠皮