RNA干擾技術沉默STAT3基因對肺腺癌A549細胞生長抑制作用的研究——應用熒光定量PCR和Western-blot檢測RNA干擾肺腺癌A549細胞STAT3基因表達水平的實驗研究.pdf

1、目的：研究RNAi技術對人肺癌A549細胞系中STAT3基因的阻斷效應，應用熒光定量PCR法和Western-blot（蛋白免疫印跡法）檢測干擾前后STAT3的表達情況，探討STAT3在肺癌發(fā)病機制中的作用，為肺癌的治療尋找新的靶點。方法：（1）化學合成siRNA并轉染A549細胞：①以肺癌A549細胞作為靶細胞，STAT3基因作為靶基因，從CNKI上搜索STAT3mRNA全基因序列，BLAST軟件進行同源性分析，以STAT3mRNA全

2、基因序列作為模板，從基因編碼區(qū)起始密碼子下游尋找符合設計特征的靶序列，根據(jù)siRNA的設計原則，設計三段表達STAT3特異shRNA的基因序列，采用化學合成法合成三條雙鏈siRNA，分別命名為sihSTAT3-1、sihSTAT3-2、sihSTAT3-3。將實驗分為siRNA1組、siRNA2組、siRNA3組、sihGAPDH陽性對照組，NControl陰性對照組及A549細胞空白對照組。②采用脂質體介導方法，將合成siRNA轉染各

3、組細胞，16小時后熒光顯微鏡觀察轉染情況，觀察轉染效率。（2）熒光定量PCR法檢測RNA干擾后STAT3mRNA抑制率：①以靶基因STAT3為目的基因、管家基因β-actin為內參基因。轉染24h后收集細胞，用TRIZOL法提取RNA，逆轉錄成cDNA，瓊脂糖凝膠電泳，檢測目的條帶。②于轉染24h、48h、72h分別收集細胞，經(jīng)逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）獲得靶基因STAT3及管家基因β-actin的cDNA產物，并作為標準品梯度

4、稀釋，采用SYBR GreenⅠ定量PCR檢測，得出標準曲線，溶解曲線及擴增曲線。⑧采用相對定量比較域值法計算STAT3mRNA相對表達倍數(shù)，得出抑制率，進行統(tǒng)計學分析。（3）應用Western-blot法檢測干擾后STAT3蛋白表達抑制率：①選擇一干擾效率較高siRNA對各組中的STAT3蛋白進行Western-blot檢測，用Bradford比色法測定蛋白含量、聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、考馬斯亮藍染色觀察蛋白條帶、電轉

5、移（electrotransfer）封閉PVDF膜、免疫反應（加入一抗和二抗）、化學發(fā)光顯示目的條帶。②將Western-blot結果掃描傳送至計算機，用Image-Proplus圖像分析軟件系統(tǒng)對蛋白條帶進行分析，以蛋白條帶的灰度值代表蛋白的表達量，用β-actin條帶灰度值進行校正，得出各條帶的相對灰度值。統(tǒng)計學分析結果。結果：（1）成功設計合成siRNA，并成功轉染肺癌A549細胞。（2）熒光定量PCR結果顯示，在轉染24h、48

6、h、72h后，各干擾組與空白組比較STAT3基因表達量明顯下調（P<0.05），siRNA-STAT3對STAT3基因的表達均抑制，其中0到48小時抑制率呈明顯上升趨勢，48小時到72小時抑制率變化不明顯。對應不同位點的三個siRNA-STAT3對STAT3mRNA表達的抑制率無明顯差異（P>0.05）；陰性對照及空白對照STAT3表達量無明顯差異（P>0.05）。（2）Western blot顯示：轉染前后STAT3蛋白的表達水平明顯

7、受到抑制，抑制率為76.92%，具有顯著差異（P<0.05），內參基因在各組的表達量無明顯差異。結論：（1）本實驗利用化學合成法成功合成了針對STAT3基因的siRNA，成功建立了STAT3基因RNA干擾技術。（2）將合成的siRNA轉染入A549細胞后，通過熒光定量PCR檢測STAT3基因表達量，和通過Western-blot檢測STAT3蛋白表達量，結果顯示：轉染后STAT3mRNA及蛋白表達量均明顯受到抑制，而對內參基因的表達影響