干預Racl活性大鼠心臟驟停全腦缺血模型中的腦保護作用.pdf

1、由各種疾?。X卒中、微血栓、腦血管痙攣和硬化、腦血液動力學改變、頸部動脈疾病或椎動脈受壓等）或手術（嚴重顱腦外傷手術、控制性降壓、顱內動脈瘤夾閉術、冠狀動脈旁路移植術以及頸動脈血管移植術、蛛網膜下腔出血等）所介導的全部或局部的腦組織短暫缺血，缺血腦組織恢復血流灌注后，腦組織損傷反而加重稱為腦缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，I/R)。
　　神經細胞對缺血性損害非常敏感，長時間的缺血打擊可導致神

2、經細胞大量死亡，難以再生，從而留下許多嚴重甚至是不可逆的后遺癥。因此，如何實現圍術期腦保護一直是臨床麻醉醫(yī)師追求的目標。研究某種能夠調動機體的內源性保護機制，提高神經細胞對缺血性損害的抵抗力，減少嚴重缺血導致的損傷，保證再灌注后神經細胞的正常生理功能，是缺血性腦病治療上的一個重要策略。探求腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機制、尋找可減輕或預防腦缺血再灌注損傷的方法或藥物，已成為近年來神經科學領域廣大科研工作者致力的研究目標。
　　全腦缺血后

3、活性氧尤其是氧自由基所引起的連鎖反應是神經元受損的核心病理環(huán)節(jié)。Rac1蛋白被認為是還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的生物調控開關，當有外源性的刺激因素存在時，Rac1與GDP脫離，并與三磷酸鳥苷GTP相結合而活化，隨后激活NADPH氧化酶從而產生活性氧簇。目前一些腦缺血再灌注研究發(fā)現在各種手段作用下降低Rac1活性將避免產生過多的活性氧參與腦缺血后神經元的死亡或凋亡，但是針對Rac1在全腦缺血中的作用及其信號轉導的調節(jié)機制方面的研

4、究仍然較少，其信號轉導通路在腦損傷后是否受到其他因素的影響目前尚未明確，作為活性氧產生通路上的“開關分子”Rac1與線粒體的抗氧化酶系統(tǒng)是否有相關調節(jié)機制參與腦缺血再灌注損傷還需進一步探索。
　　本實驗首先利用食道電極建立心室停搏CA(cardiac arrest)全腦缺血GCI(global cerebral ischemia)模型，并在全腦缺血15min前經側腦室注射Rac1特異抑制劑NSC23766(50μg)，觀察記錄大鼠

5、9天內生存情況，通過Nissl染色評價大鼠海馬CA1區(qū)在腦缺血再灌注后神經元形態(tài)學改變，觀察其中存活神經元密度。TUNEL染色檢測48h海馬CA1區(qū)的神經元細胞的凋亡情況，觀察側腦室注射Rac1特異抑制劑NSC23766是否可減輕GCI后海馬神經元損傷，證明該模型可以一定程度模擬臨床各種原因導致的心臟停搏引發(fā)的嚴重全腦缺血損害;NADPH氧化酶“開關分子”Rac1與全腦缺血再灌損傷有關。
　　第二部分以此模型為基礎研究抑制Rac1

6、活性對大鼠CA后腦神經功能和氧化應激的影響，通過側腦室注射Rac1活性抑制劑NSC23766，于CA/GCI后30min、3h、6h、1d、3d時取海馬CA1區(qū)組織檢測Rac1總量及活化蛋白含量，從WB水平驗證側腦室注射NSC23766對Rac1活性的影響，通過改良NSS評分和Morris水迷宮檢測空間學習與記憶能力的等神經功能改變，檢測超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)等指標來反映神經元的氧化應激水平，結果證明抑制Rac1活性

7、對全腦缺血再灌損傷后大鼠空間學習及記憶能力有保護作用，同時抑制Rac1活性可降低神經元氧化應激水平，提示抑制Rac1活性所產生的神經保護作用與降低神經元氧化應激水平有關。
　　第三部分則于CA/GCI后再灌注6h、1d、3d、5d各時間點檢測大鼠海馬CA1區(qū)Trx2，Prx3的蛋白時間表達分布水平，研究線粒體抗氧化酶Trx2，Prx3在Rac1抑制劑處理后大鼠腦缺血再灌注損傷中的變化，探討機體清除氧化產物的還原能力特別是線粒體抗氧

8、化酶系統(tǒng)是否被輔助激活，關注抑制Rac1活性所產生的腦保護作用是否與激活、增強神經元細胞的抗氧化酶系統(tǒng)清除活性氧能力有關。我們進一步研究線粒體抗氧化酶在全腦缺血再灌注的保護機制，期望為防治全腦I/R損傷提供新的治療靶點。
　　實驗發(fā)現:①抑制Rac1活性可明顯減少缺血再灌注所導致的遲發(fā)性神經元死亡及錐體神經細胞凋亡，并可以使大鼠的空間學習和記憶能力的減退得到明顯改善，起到在全缺血再灌注損傷中的神經保護作用。②使用Rac1抑制劑NS

9、C23766降低Rac1活性對大鼠再灌注損傷的腦保護作用與改善氧化應激水平及氧化應激的腦組織相關蛋白分子相關聯。③Rac1活性抑制劑處理后減輕大鼠腦缺血再灌注損傷降低組織氧化應激水平的機制可能與腦組織線粒體抗氧化酶Trx2、Prx3表達無關。
　　本研究為進一步闡明腦缺血再灌注損傷的機制奠定理論基礎，也為Rac1與線粒體抗氧化酶Trx2，Prx3在缺血性腦損傷的重要作用提供理論依據和治療策略，同時嘗試為治療臨床缺血性腦病提供一條新

10、的思路。
　　第一部分:抑制Rac1活性對大鼠經食道致顫腦缺血模型的神經元保護作用
　　目的:建立SD大鼠經食道電刺激心臟驟停全腦缺血再灌注模型，研究側腦室注射NSC23766抑制Rac1活性在該模型中的神經元保護作用。
　　方法:經食道插入調搏電極至心臟水平，用恒定電流誘發(fā)心臟驟停，無干預觀察6min后進行心肺復蘇。選擇雄性SD大鼠(250-300g)，隨機分為四組:Sham組，CA組，NSC組(全腦缺血15min前

11、經側腦室置管注射Rac1特異抑制劑NSC23766)，Vehicle組。記錄各組大鼠9d內生存情況，于I/R后2d檢測各組大鼠腦水腫情況，大鼠海馬CA1區(qū)行TUNEL染色記錄凋亡陽性細胞數，I/R后9d取大鼠海馬CA1區(qū)行Nissl染色，觀察存活神經元密度。
　　結果:大鼠心臟驟停后全腦缺血NSC23766治療組與CA模型組相比生存率顯著提高(P＜0.05)。NSC組與CA組相比腦水含量減少，海馬CA1區(qū)存活神經細胞數目增多(P＜

12、0.05)，遲發(fā)性神經元死亡明顯減少(P＜0.05)。
　　結論:經食道電刺激心臟驟停全腦缺血模型可模擬臨床心臟驟停后腦損害;抑制Rac1活性可明顯減少缺血再灌注所導致的遲發(fā)性神經元死亡及錐體神經細胞凋亡。
　　第二部分:抑制Rac1活性對大鼠CA后腦神經功能和氧化應激的影響
　　目的:探討抑制Rac1活性對大鼠心臟驟停全腦缺血后腦神經保護作用與氧化應激的關系。
　　方法:經食道插入調搏電極至心臟水平，用恒定電流

13、誘發(fā)心臟驟停，無干預觀察6min后進行心肺復蘇制作全腦缺血再灌注模型。選擇雄性SD大鼠(250-300g)，隨機分為四組:Sham組，CA組，NSC組，Vehicle組（CA前15min經側腦室置管注射NSC23766）。于再灌注后6h、1d、2d及4d時行NSS評分;再灌注第2d各組檢測超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)，第7d行Morris水迷宮實驗。
　　結果:缺血再灌注后6小時大鼠海馬CA1區(qū)Rac1活性明顯高于假

14、手術組（P＜0.05）。同CA組相比，NSC組缺血再灌注后6h大鼠海馬CA1區(qū)Rac1活性顯著降低，改良NSS評分各時間點都降低，Morris水迷宮實驗中缺血再灌后第7天和第8天搜索安全島平臺潛伏期、運動軌跡有明顯改善，空間探索試驗時NSC組第2象限停留時間百分比和穿越原平臺的次數明顯增加(P＜0.05）。氧化應激檢測結果顯示，缺血再灌發(fā)生時抗氧化物質SOD降低而脂質氧化標志物MDA升高，NSC組與CA組相比水平升高，MDA水平降低(P

15、＜0.05）。
　　結論:抑制Rac1活性在大鼠經食道電刺激心臟驟停全腦缺血模型中可以通過降低氧化應激水平，改善大腦缺血再灌注的神經功能損傷，發(fā)揮其在全腦I/R損傷中的神經保護作用。
　　第三部分線粒體抗氧化酶 Trx2，Prx3在大鼠腦缺血再灌注損傷中的變化
　　目的:通過評價線粒體抗氧化酶Trx2，Prx3在Rac1抑制劑處理后大鼠腦缺血再灌注損傷中的蛋白表達變化，探討線粒體抗氧化酶在大鼠腦缺血再灌注損傷的可能保護

16、機制。
　　方法:經食道插入調搏電極至心臟水平，用恒定電流誘發(fā)心臟驟停CA，無干預觀察6min后進行心肺復蘇制作全腦I/R模型。選擇雄性SD大鼠(250-300g)，隨機分為四組:Sham組，CA組，NSC組（全腦缺血15min前經側腦室注射Rac1特異抑制劑NSC23766），Vehicle組。于再灌注后6h、1d、3d、5d取海馬CA1區(qū)組織行Western blot檢測硫氧還蛋白酶Trx2及線粒體過氧化氫酶Prx3的表達。<