混合培養(yǎng)的臍血間充質干細胞移植治療HIBD新生大鼠的實驗研究.pdf

1、新生兒缺氧缺血性腦損傷(neonatal hypoxic ischemic brain damage,HIBD)是導致新生兒死亡和兒童神經系統(tǒng)傷殘的主要因為之一,目前對重度HIBD尚無特異有效的治療辦法。近年來隨著干細胞研究的進展,干細胞移植為新生兒HIBD的治療開辟了一條新途徑。干細胞移植是近年來整個生命科學領域和醫(yī)學領域的研究熱點和前沿,因其具有高度自我更新能力和多向分化潛能而成為細胞移植和組織工程中的首選細胞。
　　 造血

2、干細胞/祖細胞(hematopoietie stem cell/hematopoietic progenitorcell,HSC/HPC)存在于人臍血(human umbilical cord blood,HUCB)中,臍血中造血干細胞被成功的發(fā)現(xiàn)并已經在臨床中用于異體細胞移植治療血液系統(tǒng)疾病。間充質干細胞(mesenchymal stem cell,MSCs)是否存在于臍血中仍不十分明確。最近幾年的研究中顯示,在臍血里能培養(yǎng)出MSCs

3、來,臍血MSCs與骨髓MSCs具有相近的性質,并有多向分化潛能,它處于一定的環(huán)境中就能定向分化為神經元和神經膠質細胞。臍血MSCs移植治療在缺氧缺血性腦損傷和腦脊髓損傷的動物實驗中,觀察到移植細胞在腦組織內神經元和神經膠質細胞標志物的表達和神經功能的恢復。但是,在臨床上治療一些疾病時發(fā)現(xiàn)單份臍血細胞數(shù)量不足,為實驗研究和臨床工作帶來了一些困擾,又有文獻報道兩份臍血混合培養(yǎng)后細胞增殖快,數(shù)量多,為彌補臨床應用單份臍血MSCs數(shù)量不足提供了

4、良好的理論依據(jù)。
　　 目的
　　 觀察是否能從健康足月新生兒臍血中培養(yǎng)出臍血間充質干細胞(MSCs),觀察混合培養(yǎng)的臍血間充質干細胞和單份培養(yǎng)的臍血間充質干細胞的增殖情況,探討腦內移植混)合培養(yǎng)的人臍血間充質干細胞(MSCs)對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷(HIBD)的治療效果。為進一步進行臍血MSCs移植治療新生兒HIBD的臨床應用,提供實驗基礎和理論根據(jù)。
　　 方法：
　　 無菌條件下收集20份健康足

5、月新生兒臍血,采用密度梯度離心法分離出臍血單個核細胞,再通過貼壁細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)出人臍血MSCs。當細胞傳至第3代時,隨機取培養(yǎng)的8份臍血間充質干細胞(半量)為A組,8份臍血間充質干細胞(半量)為B組,將A、B組各剩余的半量臍血間充質干細胞混合為C組。3組細胞密度均為1.0×106/ml?；旌吓囵B(yǎng)的第3代臍血MSCs用流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD86、CD34、HLA-DR、HLA-ABC的表達。選擇P3代人臍血MSCs作為移植細胞,并

6、經5-溴-2脫氧尿苷(BrdU)體外標記。7日齡SD大鼠50只制備HIBD模型,造模過程中死亡3只,隨機選擇5只進行HE染色,剩余42只分為混合移植組(n=16)和單份移植組(n=16)和對照組(n=10)。造模后第3天,在立體定位條件下,移植組大鼠經左側大腦皮層注入人臍血MSCs,對照組在相同部位注入相同體積的PBS。在細胞移植后第7天,各隨機選擇6只移植組大鼠處死取腦,通過腦組織免疫組織化學檢測方法觀察移植細胞在腦內的存活、遷移情況

7、。于移植后第1、7、14、21、28天采用改良神經行為學評分(mNSS)方法對三組大鼠的神經功能進行評價。
　　 結果：
　　 活細胞計數(shù)顯示,將2份不同臍血間充質干細胞混合培養(yǎng)后,細胞增殖比單份臍血間充質干細胞快(P<0.05)。造模后HE染色可見大腦皮層神經細胞數(shù)量減少,胞質皺縮,核濃縮深染,核仁消失,胞漿疏松,間質水腫。海馬區(qū)錐體細胞變性,細胞間隙增大,排列紊亂。移植7天后移植組大鼠腦組織免疫組織化學檢測發(fā)現(xiàn)移植細

8、胞在腦內能夠存活,并以移植點為中心向周圍遷移,混合移植組的BrdU陽性細胞數(shù)多于單份組(P<0.05)。mNSS檢測結果顯示,移植后第1天移植組大鼠mNSS低于對照組,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),第7、14、21、28天移植組大鼠mNSS低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。第7、14、21、28天混合移植組大鼠的mNSS低于單份移植組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 結論：
　　 1在適宜的體