吲哚美辛對二氧化硅誘導的大鼠肺泡巨噬細胞溶菌酶蛋白表達的影響.pdf

1、背景與目的：矽肺是由于長期吸入含有游離二氧化硅(SiO2)粉塵而引起的以肺組織纖維化為主的全身性疾病,我國矽肺病例約占塵肺總病例50％,是危害最嚴重的一種塵肺病。矽肺纖維化發(fā)病的分子機制研究至今雖尚未完全闡明,有研究表明矽肺的發(fā)生與溶酶體酶有關。吸入的SiO2對肺泡巨噬細胞(alveolar macrophage,AM)溶酶體的損傷及伴隨的溶酶體酶向胞漿的釋放在矽肺的發(fā)病機制中起重要作用。溶菌酶(lysozyme,LSZ)是巨噬細胞溶酶

2、體中主要的水解酶之一,肺泡巨噬細胞溶菌酶可能成為一種致纖維化因子,刺激肺組織成纖維細胞增殖,導致膠原的過量合成和沉積,加速矽肺纖維化的形成。并且有研究表明LSZ比其它溶酶體水解酶更易釋放。所以本實驗采用溶菌酶作為肺泡巨噬細胞的標志酶進行研究。本實驗室前期的工作中,通過免疫組織化學、免疫細胞化學、RT-PCR的方法證明了矽塵能刺激肺泡巨噬細胞內溶菌酶表達增加,在此基礎上,我們設想在矽肺的發(fā)生發(fā)展過程中,SiO2作用于肺泡巨噬細胞以后,是否

3、可用某種藥物在細胞水平和蛋白水平上抑制SiO2誘導肺泡巨噬細胞內溶菌酶的表達上調,從而減緩對巨噬細胞和肺組織的損傷,阻止矽肺纖維化的形成。本實驗研究以溶菌酶作為大鼠肺泡巨噬細胞的標志酶,應用Western Blotting蛋白免疫印跡法對染矽塵后肺泡巨噬細胞加入不同濃度吲哚美辛(Indomethacin,IND),觀察SiO2誘導的肺泡巨噬細胞(AM)中溶菌酶蛋白的表達有無變化,吲哚美辛對SiO2誘導的肺泡巨噬細胞(AM)中溶菌酶的蛋白

4、表達有無抑制作用。從蛋白質水平探討吲哚美辛對二氧化硅誘導的肺泡巨噬細胞溶菌酶表達的影響,以期為進一步認識矽肺發(fā)病機制提供實驗依據(jù)。
　　實驗分組與方法：
　　本實驗分為二個部分，
　　1.細胞實驗采用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學改變:按改良的Myrivk法在無菌條件下進行大鼠支氣管肺泡灌洗,灌洗液經1500 rpm離心15 min,棄上清,用PBS(phosphate buffer saline,PBS)洗滌一次,合并混勻

5、,加入含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基,放入37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),2 h后用PBS洗滌,洗去雜細胞和未貼壁的肺泡巨噬細胞,即得較純的AM。將純化的AM換入不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中,按是否加入SiO2和吲哚美辛處理分為對照組、模型組和干預組。干預組又分為低、中、高三個劑量依次為10-5g/ml、10-4g/ml、10-3g/ml,分別用IND1、IND2、IND3表示。模型組加入SiO250μg/ml粉塵懸液

6、復制矽塵中毒模型,干預組在加入SiO250μg/ml粉塵懸液的同時加入相應濃度的IND;對照組給予同體積PBS。37℃培養(yǎng)8 h后在倒置顯微鏡上拍攝細胞圖片。2.Western Blotting蛋白免疫印跡實驗將上述處理的肺泡巨噬細胞(AM)在培養(yǎng)8 h、16 h后收集的細胞,按分組進行蛋白質提取。再將所提取的蛋白質進行Western Blotting蛋白免疫印跡實驗,檢測LSZ在AM中的表達,并用Quantity One軟件結合圖像對

7、LSZ的表達進行半定量分析。結果1.細胞實驗:純化并經過處理的肺泡巨噬細胞(AM)在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 h后在倒置顯微鏡下拍照,發(fā)現(xiàn)對照組細胞貼壁生長良好。模型SiO2組經50μg/mlSiO2刺激8h后肺泡巨噬細胞腫脹變形,并出現(xiàn)細胞碎片。而干預組加入吲哚美辛藥物的AM細胞形態(tài)與模型組相比較細胞相對完整,且有濃度依賴趨勢。
　　2.Western Blotting蛋白免疫印跡實驗:經50μg/ml SiO2刺激8h、

8、16h后,模型組肺泡巨噬細胞內LSZ蛋白表達與陰性對照組相比明顯上調,干預組加藥后對SiO2誘導的肺泡巨噬細胞內LSZ蛋白表達均有下降趨勢。1)模型組AMS在8 h和16 h兩個時間點溶菌酶(LSZ)蛋白表達均高于對照組,分別是對照組的1.945、2.285倍,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.0125)。2)干預組在8 h和16 h兩個時間LSZ蛋白表達均低于模型組,在8 h時間點與模型組比較(分別是對照組的1.586、1.055、0.86

9、4倍),中、高劑量組的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.0125);在16 h時間點LSZ蛋白表達低于模型組(分別是對照組的1.544、1.481、0.908倍),與模型組比較僅高劑量組的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.0125)。
　　結論：本研究在分析國內外矽肺發(fā)病機理的基礎上,提出矽塵可誘導肺泡巨噬細胞溶菌酶蛋白表達增加的設想,并通過Western Blotting蛋白免疫印跡法在蛋白水平上證明矽塵可誘導肺泡巨噬細胞溶菌酶表達的增加,