rhBMP-2緩釋體對鉻顆粒誘導的溶骨效應(yīng)的影響.pdf

1、研究背景:
　　 人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是目前治療晚期骨關(guān)節(jié)疾病的有效方法，其能有效的解除關(guān)節(jié)疼痛、恢復關(guān)節(jié)活動功能，提高患者生活質(zhì)量。目前全世界每年超過200萬人接受人工關(guān)節(jié)置換術(shù)，其中行翻修手術(shù)者達到了20％左右。關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染、假體無菌性松動、假體周圍骨折、關(guān)節(jié)不穩(wěn)定和關(guān)節(jié)活動受限等是關(guān)節(jié)置換術(shù)后需要翻修的常見原因。其中關(guān)節(jié)假體周圍骨溶解引起的假體無菌性松動(asepticloosening)是影響人工關(guān)節(jié)使用壽命的主要原因之一

2、。隨著關(guān)節(jié)置換術(shù)在臨床上的廣泛應(yīng)用以及時間的推移，關(guān)節(jié)置換術(shù)后翻修的患者越來越多，假體周圍骨溶解引起的假體無菌性松動作為影響人工關(guān)節(jié)使用壽命的主要原因之一，其越來越受到關(guān)注。假體無菌性松動晚期患者，為解除疼痛和提高生活質(zhì)量，必須行關(guān)節(jié)翻修手術(shù)?；颊咭鎸﹄y度大、風險高及費用多等問題。如何能找到一種非手術(shù)方法來預(yù)防和治療假體周圍骨溶解已成為非常迫切和現(xiàn)實的問題。
　　 骨組織正常結(jié)構(gòu)功能的維持是個動態(tài)平衡過程，這一平衡由骨形成代謝

3、和骨吸收代謝組成，一定量骨吸收后會有等量的骨形成。RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)是破骨細胞分化、激活和凋亡過程中的一個重要信號調(diào)節(jié)系統(tǒng)，這一系統(tǒng)不僅參與調(diào)節(jié)生理性骨重建，也與病理狀態(tài)下多種骨病的發(fā)生密切相關(guān)。核因子κB受體活化因子配體(recetoractivatorofnuclearfactorκBligand，RANKL)與核因子κB受體活化因子(recetoractivatorofnuclearfactorκB，RANK)相結(jié)合

4、，誘導破骨細胞分化，促進溶骨。骨保護素(Osteoprotegerin，OPG)可抑制RANKL的作用，抑制破骨細胞活化，促進成骨。成骨細胞和骨髓基質(zhì)細胞在生理狀態(tài)下表達一定量的RANKL，促進破骨細胞的分化和骨吸收，同時又分泌相應(yīng)數(shù)量的OPG，防止骨的過度吸收，因此RANKL/OPG的比例協(xié)調(diào)是維持局部骨代謝平衡的關(guān)鍵。RANKL/OPG的比例或者RANK信號的失衡成為了許多骨骼疾病的病理基礎(chǔ)，表現(xiàn)為過度骨丟失、過度骨形成或者骨的重建

5、紊亂。由此可見，RANKL和OPG對骨吸收是同樣重要的因子，RANKL和OPG的平衡失調(diào)是導致破骨細胞分化、出現(xiàn)骨溶解、骨量丟失的關(guān)鍵性因素。所以假體周圍骨組織中RANKL/OPG的平衡情況可反映假體周圍骨代謝情況。
　　 人工關(guān)節(jié)界面之間由于長期的運動摩擦可產(chǎn)生聚乙烯、骨水泥和金屬等顆粒。這些磨損顆可釋放許多溶骨因子，如:白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等，這些溶骨因子可刺激破

6、骨細胞的前體細胞RANKL基因的表達，同時抑制OPG的產(chǎn)量，引起假體周圍骨組織中的RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)平衡失調(diào)，RANKL/OPG的比值增加，實現(xiàn)破骨細胞的分化與活化，促進假體周圍破骨細胞增殖、減少成骨細胞增殖和細胞外基質(zhì)分泌，造成假體周圍溶骨增加、成骨減少，最終導致假體無菌性松動。由此可見，消除和逆轉(zhuǎn)RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)中的RANKL/OPG的比值失衡，可能是治療假體無菌性松動的靶點。
　　 骨形態(tài)發(fā)生

7、蛋白（bonemorphogeneticprotein，BMP）是目前促進成骨作用最強的物質(zhì)，能誘導細胞向骨及軟骨方向轉(zhuǎn)化。BMP屬于轉(zhuǎn)化生長因子(transforminggrowthfactor，TGF)-β超家族成員，超過40種BMP已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，其中BMP-2有最高的成骨活性，是體內(nèi)成骨重要的促進因子，能跨種誘導未分化間充質(zhì)干細胞向成骨細胞方向增殖和分化，促進成骨。BMP-2調(diào)控骨代謝過程中成骨細胞和破骨細胞的分化、增殖與功能活性，

8、并通過自分泌、旁分泌和細胞黏附方式在細胞及細胞間質(zhì)之間傳導信息，調(diào)節(jié)骨細胞的分化和增殖，在骨重建中發(fā)揮重要作用。BMP-2的具體作用途徑是:BMP-2在細胞外通過信號轉(zhuǎn)導，在細胞內(nèi)部和抑制性smad蛋白結(jié)合，使抑制性smad蛋白表達上調(diào)，這些smad蛋白經(jīng)磷酸化后轉(zhuǎn)運至核內(nèi)，調(diào)控目的基因與其他轉(zhuǎn)錄因子（包含PEBP2-α/Cbfa1)，與BMP-2激動的smad蛋白協(xié)調(diào)誘導成骨細胞表型相關(guān)基因的表達，促進成骨細胞分化與增殖。BMP-2參

9、與了骨代謝的各個階段，誘導骨內(nèi)、外膜和骨髓基質(zhì)細胞分化為骨母細胞，加強了骨床再生能力，同時活化或誘導血管周圍的間充質(zhì)細胞分化為軟骨和成骨細胞，是骨代謝過程中重要的骨形成因子。近年來關(guān)于BMP-2作用的研究越來越多，其在骨代謝過程中的的調(diào)節(jié)作用越來越受到重視，BMP-2可能是臨床防治金屬磨損顆粒引起假體無菌性松動的有效方法。
　　 本文通過金屬磨損顆粒誘導產(chǎn)生模擬假體無菌性松動的大鼠植骨氣囊模型，對大鼠植骨氣囊模型囊腔內(nèi)骨片行TR

10、AP染色，用計算機圖像分析技術(shù)測定骨片破骨細胞染色面積比率，評估骨片中的骨吸收情況;用Western-blot和RT-PCR檢測方法檢測骨片中RANKL、OPG的表達情況，評估骨片中的骨代謝情況;評價rhBMP-2對模型中骨片的骨吸收情況及RANKL、OPG表達的影響，探究rhBMP-2在防治假體無菌性松動方面的作用。為假體無菌性松動的防治探索一種新的方法。
　　 目的:
　　 1.通過構(gòu)建大鼠植骨氣囊模型和進行不同濃度

11、的rhBMP-2緩釋體干預(yù)，觀察不同濃度rhBMP-2緩釋體對氣囊內(nèi)組織的骨吸收情況及RANKL、OPG表達的影響，評估rhBMP-2在動物模型中的抗骨溶解作用。
　　 2.初步探討rhBMP-2在防治假體無菌性松動方面的意義及可行性。
　　 方法:
　　 在實驗用的60只SD大鼠中，選取50只（剩余10只作為周圍囊腔內(nèi)骨片供體），隨機分成5組（空白組、鉻顆粒組、50μg/mlrhBMP-2緩釋體+鉻顆粒組、10

12、0μg/mlrhBMP-2緩釋體+鉻顆粒組和200μg/mlrhBMP-2緩釋體+鉻顆粒組），在大鼠腹背部注入過濾后的空氣20ml，每2天1次，共3次，構(gòu)建氣囊。1周后，如注射部位無紅腫、流膿、硬結(jié)及滲出等明顯炎癥反應(yīng)，則表示動物氣囊模型構(gòu)建成功。處死另外10只大鼠，取顱骨片，將骨片修整成為約10mmX10mm大小，去除干凈周圍軟組織并注意保護骨片表面骨膜。對氣囊模型構(gòu)建成功的大鼠行腹腔麻醉，麻醉成功后，將修整好的骨片植入氣囊中。在植骨

13、氣囊模型構(gòu)建成功24小時后，空白組的大鼠氣囊內(nèi)注入6ml生理鹽水，鉻顆粒組的大鼠氣囊內(nèi)注入2ml鉻顆粒懸液和4ml生理鹽水，50μg/mlrhBMP-2緩釋體+鉻顆粒組、100μg/mlrhBMP-2緩釋體+鉻顆粒組、200μg/mlrhBMP-2緩釋體+鉻顆粒組的大鼠氣囊內(nèi)除均注入2ml鉻顆粒懸液外，還相應(yīng)的分別注入超聲分散后的50μg/ml、100μg/ml、200μg/mlrhBMP-2緩釋體懸液4ml。正常飼養(yǎng)2周后，處死動物，

14、取囊腔組織。對囊腔內(nèi)骨片行TRAP染色，采用Imageproplus5.0軟件測量骨片破骨細胞染色面積比率;用Wester-blot檢測方法檢測囊腔內(nèi)組織的RANKL、OPG的表達情況;用Rt-PCR檢測方法檢測囊腔內(nèi)組織的RANKmRNA、OPGmRNA的表達情況;記錄各組的相關(guān)檢測結(jié)果，采用SPSS13.0軟件行One-WayANOVA，比較各組均數(shù)，以P＜0.05表示有顯著性差異，評估rhBMP-2緩釋體對囊腔內(nèi)骨片的骨代謝的影響

15、。
　　 結(jié)果:
　　 1.囊腔內(nèi)組織RANKL、OPG的Wester-blot檢測結(jié)果提示:RANKL、OPG在各組動物模型囊腔組織中均有表達。在鉻顆粒組囊腔組織中的RANKL、OPG表達及RANKL/OPG值均明顯高于其他4組(均P＜0.05)。在3個rhBMP-2緩釋體干預(yù)組囊腔組織內(nèi)，RANKL、OPG的表達及RANKL/OPG值均隨著rhBMP-2緩釋體濃度增高而遞減，組間差異均有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05)。

16、在空白組和200μg/mlrhBMP-2緩釋體+鉻顆粒組的囊腔組織內(nèi)，RANKL、OPG的表達及RANKL/OPG值均未見明顯差異（均P＞0.05）。
　　 2.骨片行TRAP染色后，Imageproplus5.0軟件測量骨片破骨細胞染色面積比率的結(jié)果顯示:各組動物模型囊腔內(nèi)骨片均可見TRAP染色的破骨細胞。鉻顆粒組囊腔內(nèi)的骨片破骨細胞染色面積比率明顯高于其他4組(均P＜0.05)。3個rhBMP-2緩釋體干預(yù)組囊腔內(nèi)骨片破骨細

17、胞染色面積比率隨著rhBMP-2緩釋體濃度增高而遞減，組間差異均有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05)。空白組和200μg/mlrhBMP-2緩釋體+鉻顆粒組的囊腔內(nèi)骨片破骨細胞染色面積比率相互比較未見明顯差異(P=0.844，P＞0.05)。
　　 3.囊腔內(nèi)組織RANKL、OPG的RT-PCR檢測結(jié)果提示:RANKLmRNA、OPGmRNA在各組動物模型囊腔組織中均有表達。在鉻顆粒組囊腔組織中的RANKLmRNA、OPGmRNA表達

18、及RANKLmRNA/OPGmRNA值均明顯高于其他4組(均P＜0.05)。在3個rhBMP-2緩釋體干預(yù)組囊腔組織內(nèi)，RANKLmRNA、OPGmRNA的表達及RANKLmRNA/OPGmRNA值均隨著rhBMP-2緩釋體濃度增高而遞減，組間差異均有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05)。在空白組和200μg/mlrhBMP-2緩釋體+鉻顆粒組的囊腔組織內(nèi)，RANKLmRNA、OPGmRNA的表達及RANKLmRNA/OPGmRNA值均未見明顯

19、差異（均P＞0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1.鉻顆?？梢砸鸫笫笾补菤饽夷Ｐ徒M織內(nèi)的RANKL/OPG值升高，促進溶骨。大鼠植骨氣囊模型成功的模擬了人工關(guān)節(jié)無菌性松動的生物學和組織學特征。
　　 2.實驗結(jié)果中RANKL/OPG值與骨片破骨細胞染色面積比率存在的正相關(guān)性，又一次證明了RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)的RANKL/OPG值可反映骨代謝過程中的骨代謝情況。
　　 3.在一定濃度范圍內(nèi)，rh