重組人促紅素異構體分析及報告基因法測定其生物學活性的初步研究.pdf

1、人促紅素（Erythropoietin，EPO)是一種刺激紅細胞生成的糖蛋白激素，由腎臟合成分泌，作用于骨髓，刺激紅細胞的生成。重組人促紅素（rHuEPO）是一種應用基因工程技術將人 EPO基因轉入哺乳動物細胞內(nèi)，高效表達的能夠刺激紅細胞生成的糖蛋白，主要用于治療慢性腎功能衰竭和癌癥化療產(chǎn)生的貧血。
　　rHuEPO的分子骨架是由165個氨基酸組成的肽鏈，肽鏈上有3個N-連接的糖基化位點和1個O-連接的糖基化位點，完整的EPO分子

2、中糖基部分高達相對分子量的40％。rHuEPO的生物學活性不僅與氨基酸序列有相關性，而且與蛋白的糖基化程度密切相關。糖鏈的完整性直接決定 rHuEPO在體內(nèi)的穩(wěn)定性和活性，特別是糖鏈末端的唾液酸殘基對rHuEPO的體內(nèi)生物學至關重要。但是在實際生產(chǎn)過程中，宿主細胞、生產(chǎn)發(fā)酵和分離純化工藝會影響 rHuEPO的糖基化程度，進而影響 rHuEPO產(chǎn)品的質量?，F(xiàn)在國內(nèi)外沒有統(tǒng)一糖的分析手段，測定糖蛋白異構體的方法主要有毛細管電泳（CE)、等電

3、聚焦(IEF)、SDS-PAGE電泳技術和離子色譜技術（HPAEC)。
　　論文第一部分建立了一種新的rHuEPO異構體分析方法，即成像毛細管等電聚焦法，對HuEPO樣品的異構體進行分析，該方法較平板等點聚焦法而言，重復性好，耗時短，操作簡單。同時我們也測定 rHuEPO糖鏈的結構和組成，分析糖鏈和異構體與生物活性之間的相關性，為rHuEPO的質控提供指導。
　　論文第二部分則對rHuEPO的活性檢測新方法的研究，即報告基因

4、法測定重組人促紅素生物活性的初步研究。現(xiàn)在 rHuEPO活性檢測方法主要有兩種：網(wǎng)織紅細胞計數(shù)法和UT-7/EPO細胞法。應用網(wǎng)織紅細胞法測定 rHuEPO的生物學活性，有明顯的缺陷，需要使用動物，實驗周期長，并且存在實驗動物的個體差異，實驗的重復性不太理想。雖然 EPO依賴株 UT-7細胞法較網(wǎng)織紅細胞計數(shù)法操作簡單，成本較低，不能精確定量。
　　隨著報告技術的的發(fā)展成熟和EPO信號通路闡明，使得我們能夠利用這些成功建立 EPO

5、活性測定的新方法。EPO信號通路中比較復雜，在 UT-7細胞中，JAK2/STAT5、RAS/MAPK通路均可以激活并并 bcl-xl基因的表達。熒光素酶是高靈敏的報告基因。在本文中，我們將 bcl-xl啟動子基因插入到含有熒光素酶基因的PGL4.17質粒上，成功構建了含有bcl-xl啟動子的熒光報告質粒 P1和P2。我們將構建的報告基因質粒轉染于293細胞，初步測定這兩個報告基因質粒是有活性的。我們將熒光報告基因質粒電轉染于 UT-7