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文檔簡介
1、第一部分應用雙向電泳-飛行時間質譜技術分析肝癌血清蛋白質組 目的:運用蛋白質組學雙向凝膠電泳和飛行時間質譜技術,研究原發(fā)性肝細胞癌患者與肝硬化及正常健康個體血清蛋白質組表達圖譜的差異,尋找和確定原發(fā)性肝細胞癌特征性的血清標志物,為肝癌的臨床早期診斷與治療提供實驗室參考依據。 方法: 收集原發(fā)性肝細胞癌患者、肝硬化患者與正常人血清標本各25例,血清預處理除去白蛋白和免疫球蛋白,雙向凝膠電泳的第一向電泳采用固相pH梯
2、度電泳,第二向采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析血清蛋白質組成分。電泳后經銀染或考馬斯亮藍染色,ImageMaster雙向凝膠電泳軟件分析,將有意義的差異蛋白質點膠內胰蛋白酶解,經過基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS) 分析肽質量指紋圖譜,數據庫搜索鑒定蛋白質。在驗證組血清標本(包括26例肝癌、19例肝硬化、25例正常人)和組織標本(包括10例肝癌及癌旁組織、6例正常肝組織) 中應用Western blottin
3、g 和 RT-PCR 方法進行差異蛋白mRNA和蛋白表達水平的驗證。應用生物信息學技術對差異蛋白進行結構和生物學功能分析和預測。 結果: 1.原發(fā)性肝細胞癌患者血清與肝硬化及正常健康個體血清相比較,經雙向凝膠電泳軟件分析,共找到33個差異表達的蛋白質點,分布在圖譜中的5個區(qū)域內。通過數據庫檢索分析和鑒定后發(fā)現,同一個區(qū)域的蛋白質均為同一種蛋白。與肝硬化和正常人比較,血清白蛋白(去除后的部分殘留)、血清轉鐵蛋白、CD5抗原
4、類蛋白(IgM相關肽)在肝細胞癌中低表達,鋅-α2糖蛋白(ZAG)和免疫球蛋白γ-1 鏈C區(qū)在肝細胞癌中高表達。此外,本項研究還對雙向電泳的關鍵步驟進行了改進和優(yōu)化,得到了較好的效果。 2.經血清免疫印跡驗證分析,肝癌血清中鋅-α2糖蛋白(ZAG)表達與肝硬化、正常人比較明顯增高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中,26例ZAG蛋白高表達的肝癌病例中包括5例AFP陰性(AFP<20ug/L)肝癌患者和6例小肝癌(直徑≤3cm
5、)肝癌患者。肝癌組織的RT-pCR和Western blotting驗證結果顯示,ZAGmRNA和ZAG 蛋白的表達在肝癌組織中明顯高于癌旁組織和正常肝組織,以β-actin 作為內對照,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 3.對鋅-α2糖蛋白的生物信息學分析顯示,ZAG基因定位于染色體7q22.1,ZAG蛋白為分泌性蛋白,從蛋白序列和結構上看,其結構上有一個和Ⅰ型MHC肽段結合凹槽相似的大凹槽,在這個凹槽中包含了一種非肽段的化
6、合物,這可能和正?;虿±項l件下的脂類代謝相關。ZAG是一種新的脂類動員因子,促進降脂作用,在癌性惡病質形成中起作用。 小結: 1.根據蛋白質不同的分子量和等電點,通過雙向凝膠電泳技術可將人血清中蛋白質成分進行分離,并可利用分析軟件,找到不同疾病狀態(tài)下血清中的差異蛋白質。 2.原發(fā)性肝細胞癌與肝硬化、正常人相比,在血清蛋白質組成分中存在差異。血清白蛋白(去除后的部分殘留)、血清轉鐵蛋白、CD5抗原類蛋白(IgM 相
7、關肽)在肝癌中低表達,鋅-α2糖蛋白和免疫球蛋白γ-1鏈C區(qū)在肝癌中高表達。其中,CD5 抗原類蛋白(IgM相關肽) 和鋅-α2糖蛋白與肝細胞癌之間的相關性研究目前尚未見報道。本項研究找到的這些差異蛋白質為進一步完善原發(fā)性肝細胞癌血清學診斷指標提供了參考依據。 3.對鋅-α2糖蛋白的初步驗證結果提示,其與肝細胞癌密切相關,可作為肝癌早期輔助診斷的潛在血清標記物和可能存在的治療靶點,值得進一步深入研究。 第二部分應用SEL
8、DI-TOF MS蛋白質芯片技術分析肝細胞癌血清蛋白質指紋圖譜 目的:運用表面增強激光解吸離子化飛行時間質譜(Surface-enanced laser desorptio/ionization-time of flight mass spectrometry,SELDI-TOF MS)蛋白質芯片技術檢測肝細胞癌患者、肝硬化患者和正常人血清蛋白質指紋圖譜表達差異,篩選肝癌特征性血清標志物。為肝癌的臨床早期診斷和藥物靶點篩選提供可
9、靠的、準確靈敏的實驗室參考指標。 方法:應用SELDI-TOF MS蛋白質芯片技術檢測肝細胞癌患者、肝硬化患者和性別、年齡匹配的正常健康人血清各25例,獲得弱陽離子交換(WCX2)蛋白質芯片和疏水型(H4)蛋白質芯片的蛋白質指紋圖譜。用 BioMarker Wizard、Biomarker Pattern 專用軟件分析肝癌和肝硬化及正常人血清的差異蛋白質/多肽。用驗證組血清標本(26例肝癌、19例肝硬化、25例正常人)對模型進行
10、盲法測試驗證,得出判斷模型的靈敏度和特異性。應用生物信息學對差異性蛋白/多肽搜索數據庫進行初步鑒定。 結果: 1.應用WCX2芯片和H4芯片在肝癌患者、肝硬化和正常人血清中檢測到在不同質荷比處分別有六個和四個差異蛋白質峰。經過BioMarker Wizard軟件分析,質荷比(M/Z)為6489Da(P1)、6662Da(P2)、8582Da(P9)、8720Da(P4)、8960Da(P5和P10)處的五個差異蛋白質峰在
11、肝癌組明顯低于肝硬化組和正常人組;質荷比為5552Da(P7)、7748Da(P8)、7777Da(P3)、9250Da(P6) 處的四個差異蛋白質峰在肝癌組明顯高于肝硬化組和正常人組,差異蛋白質峰含量差異有統(tǒng)計學意義。 2.利用Biomarker Pattern軟件對驗證組70例血清標本(包括26例肝癌、19例肝硬化、25例正常人)進行盲法測試,結果發(fā)現5552Da、7748Da、7777Da、9250Da 這四個多肽組成的預
12、測模型能夠對肝癌患者進行鑒別。靈敏度為92.3%(24/26,其中5例AFP<20ng/ml的肝癌患者中有3例被正確分到肝癌組;6例小肝癌全部被正確分到肝癌組),特異性為95.5%(42/44)。 3.對篩選出的差異多肽進行數據庫搜索分別得到了與之分子量最為接近的多肽,分別為:P1:Galantn 相關肽,P2:Neuregulin-4,P3:小誘導細胞因子CCL-15,P4:CSL-型鋅指包涵蛋白,P5和P10:ATP合酶偶聯(lián)
13、因子6,P6:泛醌-細胞色素C還原酶復合物線粒體前體,P7:轉化生長因子-α前體,P8:成熟T細胞增殖因子-1型A,P9:載脂蛋白 A-Ⅱ前體。 小結: 1. 應用SELDI-TOF MS蛋白質芯片技術篩選肝癌患者血清特異性生物標志物的方法快速、有效,操作自動化。建立的診斷模型預測肝癌的靈敏度為92.3%,特異性為95.5%,優(yōu)于現有AFP和B超等診斷指標。 2. 檢測到的這九種差異蛋白質/多肽可能參與了肝癌的發(fā)
14、生、發(fā)展過程,有可能成為治療肝癌的候選藥物靶點。 3. SLEDI-TOF MS蛋白芯片技術用于分析血清蛋白質組成分的方法靈敏度和特異性均較高,有望成為臨床上腫瘤早期診斷的重要檢測方法。 綜合以上兩部分的研究結論: 1. 應用血清蛋白質組學分析方法,尋找可用作肝癌早期診斷或治療靶點的新的血清標志物,這樣的研究思路是可行的。 2. 應用雙向電泳聯(lián)合質譜技術,分析了肝癌、肝硬化和正常人各25例血清標本,血清白
15、蛋白(去除后的部分殘留)、血清轉鐵蛋白、CD5抗原類蛋白(IgM相關肽) 在肝癌中低表達,鋅-α2糖蛋白和免疫球蛋白γ-1鏈C區(qū)在肝癌中高表達。鋅-α2糖蛋白基因定位于染色體7q22.1,蛋白為分泌性蛋白,與Ⅰ型MHC有高度相似性結構,是一種新的脂類動員因子,促進降脂作用,在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制有待進一步研究。 3. 應用SELDI-TOF MS蛋白質芯片技術分析了肝癌、肝硬化和正常人各25例血清標本,肝癌組在質荷比為64
16、89Da、6662Da、8582Da、8720Da、8960Da處的五個蛋白質峰明顯減低;肝癌組在質荷比為5552Da、7748Da、7777Da、9250Da處的四個蛋白質峰明顯升高。應用 5552Da、7748Da、7777Da、9250Da這四個組成的預測模型能夠對肝癌患者進行鑒別,靈敏度為92.3%,特異性為95.5%,優(yōu)于現有AFP和B超等診斷指標。通過數據庫搜索,初步鑒定了九種差異多肽。 4.通過雙向電泳和SELDI
17、-TOF MS蛋白質芯片技術研究血清蛋白質組成分差異,兩種方法各有優(yōu)點和不足。雙向電泳方法篩選到的差異蛋白質為分子量中等大小的蛋白質(10KD
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