體外臍血間充質干細胞的培養(yǎng)及其向肝細胞樣細胞誘導分化的初步研究.pdf

1、目的：從臍血中提取間充質干細胞，進行體外擴增，摸索臍血間充質干細胞在體外的適宜培養(yǎng)環(huán)境。探討間充質干細胞在體外分化為肝細胞的可能性和適宜條件。 方法： 1.待胎兒娩出斷臍后，無菌條件下采血，并用肝素抗凝。使用相對密度為1.077的ficoll淋巴細胞分離液，利用密度梯度離心原理分離臍血單個核細胞。 2.貼壁培養(yǎng)法，比較不同接種密度、不同血清濃度條件下，間充質干細胞的貼壁情況。從而摸索臍血來源間充質干細胞的適宜培養(yǎng)

2、環(huán)境。 3.收集4代的細胞，用流式細胞技術檢測細胞表面CD29、CD44、CD34、CD45的表達情況，來鑒定細胞表面的標志物。 4.常規(guī)方法凍存和復蘇間充質干細胞，觀察復蘇后細胞的生長情況。 5.收集4-8代的細胞，分成5個誘導組。分別采用與正常肝細胞株LO2分層共同培養(yǎng)法、細胞因子聯(lián)合誘導法及細胞因子階段誘導法，觀察細胞形態(tài)的變化。 6.采用RT-PCR，檢測白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)及角質

3、蛋白(CK19)mRNA的表達情況，來鑒定間充質干細胞的誘導分化情況。 結果： 1.108/ml的接種密度，7d后首次換液，可獲得較大密度的間充質干細胞，實現(xiàn)體外生長增殖。 2.5％的血清，細胞不易貼壁、增殖緩慢。10％-15％的血清，有利于干細胞的生長增殖，且不易發(fā)生形態(tài)變化。20％的血清，細胞生長快，但易發(fā)生形態(tài)改變。 3.流式細胞技術分析：CD29(+)、CD44(+)、CD34(-)、CD45(-

4、)，與間質干細胞表面標志物的的特點一致。RT-PCR分析：間充質干細胞不表達ALB、AFP及CK19。 4.本實驗所獲得的間充質干細胞體外傳8代后，細胞增殖能力明顯減弱，體積變大，呈不規(guī)則形。第10代時，無法繼續(xù)傳代，細胞死亡。復蘇后，間充質干細胞要經(jīng)歷1w的平臺期后，才能逐漸恢復凍存前的狀態(tài)。 5.第1誘導組(與LO2共同培養(yǎng))、第2誘導組(A組誘導液)、第3誘導組(與LO2共同培養(yǎng)+A組誘導液)誘導6w，較對照組未見

5、形態(tài)學變化，也未檢測到ALB、AFP及CK19mRNA的表達。 6.第4誘導組(B組誘導液)誘導6w,細胞形態(tài)也未有改變，未檢測到ALB、AFP及CK19mRNA的表達。 7.第5誘導組(C組誘導液)誘導4w，細胞由長梭型變?yōu)槎嘟切?，RT-PCR檢測到AFPmRNA的陽性表達，繼續(xù)誘導2w后，檢測到AFPmRNA、ALBmRNA、CK19mRNA的陽性表達。但細胞死亡較多，增殖能力差，細胞密度減少明顯。 結論：

6、 1.臍血中含有間充質干細胞，但含量少，不同個體之間也存在生物學差異。臍血MSCs貼壁較骨髓MSCs晚，體外培養(yǎng)困難。要想實現(xiàn)體外擴增，需要高密度接種、較高的血清濃度，以10.15％為宜。但血清濃度也不能過高，過高的血清濃度(>20％)促進細胞分化，增殖能力明顯降低。 2.體外培養(yǎng)的MSCs，傳代能力有限，P4-P8代細胞活力好。P10代細胞死亡，目前尚無法實現(xiàn)MSCs的體外無限增殖。凍存后的MSCs，復蘇后，生長緩慢，需