5-脂氧化酶轉基因小鼠模型的建立.pdf

1、目的：
　　 動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是一種嚴重危害人類健康的疾病,是導致心肌梗死、腦卒中等疾病的危險因素。目前國內外研究熱點多集中于從基因誘導方面研究AS形成的病理機制,近年來證據表明5-脂氧化酶(5-lipoxygenase,5-LO)途徑在動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展以及動脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性中有非常重要的作用。目前已利用5-LO敲除小鼠實驗證明5-LO基因與AS發(fā)病密切相關,但5-LO缺陷小鼠

2、并不能模擬AS病人在5-LO基因高表達狀態(tài)下導致的一系列炎癥反應過程,而5-LO過表達轉基因小鼠模型將克服基因敲除小鼠的不足,可能成為研究AS炎癥機制的理想模型。本實驗利用融合表達載體pEGFP-5LO穩(wěn)定轉染RAW264.7細胞并初步研究其表達情況,通過顯微注射法,建立5-LO過表達轉基因小鼠模型,為探索5-LO基因對AS的防治作用奠定基礎。
　　 方法
　　 提取人外周血總RNA作為模版,根據GenBank中5-LO

3、基因序列設計一對引物,通過RT-PCR方法擴增出2000bp的5-LO基因全長,克隆到pUCm-T載體,通過測序證實序列的正確性。用EcoR Ⅰ酶切載體pEGFP-C2和pUCm-5-LO連接產物,回收、連接、轉化、鑒定,從而成功構建了pEGFP-5-LO表達質粒。將pEGFP-5-LO表達質粒體外穩(wěn)定轉染小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞,以轉染空載體pEGFP-C2的RAW264.7細胞作對照,應用RT-PCR和Western-bl

4、ot方法分析5-LO在RAW264.7細胞中的表達情況。pEGFP-5-L0質粒經StuⅠ單酶切,QIAquick Gel extraction Kit試劑盒純化回收約6.Skp目的片斷,應用顯微注射法將外源目的基因導入受精卵原核中,并將注射后的受精卵移植到同期受孕的假孕母鼠輸卵管中,提取新生小鼠鼠尾基因組DNA,進行PCR和Southern blot方法鑒定,并應用RT-PCR、Western-blot、免疫組織化學等方法分析5-LO

5、基因在轉基因陽性小鼠各組織的轉錄特征和表達情況。
　　 結果
　　 重組質粒經酶切、測序等分析等均與預期相符,說明成功構建了pEGFP-5-LO表達質粒。通過G418篩選出穩(wěn)定轉染5-LO的RAW264.7細胞株,RT-PCR的方法檢測到5-LO mRNA的轉錄活性明顯較空白對照及轉染空載體pEGFP-C2的RAW264.7細胞增強(P<0.05),進一步用Western-blot方法檢測到5-LO的蛋白表達水平明顯較空

6、白對照及轉染空載體pEGFP-C2的RAW264.7細胞增強(P<0.05),說明轉染成功并且5-LO基因得到表達。顯微注射166枚受精卵,并將90枚注射過的受精卵移植于3只ICR受體小鼠的輸卵管中,得到25只F0代轉基因小鼠。PCR、Southern雜交檢測轉基因陽性鼠7只,編號為1、9、13、17、20、22、24。應用RT-PCR的方法檢測到轉基因小鼠的骨髓細胞、腹腔細胞、腎、脾組織5-LO、FLAP、及下游相關因子的mRNA較正

7、常鼠轉錄增強。Western-blot方法分析得到轉基因陽性鼠骨髓細胞、腹腔細胞、腎、脾組織中5-LO、FLAP蛋白的表達明顯高于正常鼠(P<0.05)；免疫組織化學等方法分析得到在轉基因陽性鼠腎、脾組織中5-LO、FLAP蛋白的表達明顯高于正常鼠。
　　 結論
　　 pFGFP-5-LO質粒體外穩(wěn)定轉染RAW264.7細胞,可以有效地使5-LO在R NA水平和蛋白質水平都具有較正常RAW264.7細胞的高表達；5-LO