Pim-3對抗心肌急性損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、上世紀中葉人們發(fā)現(xiàn)，某些情況下組織器官缺血后恢復血流，不但不能減輕損傷反而導致?lián)p傷進一步加重和器官功能障礙。這種缺血組織在恢復血液灌注后，超微結構、代謝、功能以及電生理方面發(fā)生進一步損傷的現(xiàn)象被稱為缺血/再灌注損傷（ischemia/reperfusion injury，IRI）。近年來，臨床醫(yī)生發(fā)現(xiàn)在休克治療、心肺腦復蘇、心絞痛冠脈解痙、心腦血管栓塞再通、體外循環(huán)心內直視手術、經(jīng)皮腔內冠狀動脈成形術、臟器和肢體移植、外科燒傷植皮等情況

2、下均有IRI發(fā)生，是造成手術后病人病情惡化的一個重要原因。如何減少再灌注所造成的損傷已成為當前臨床相關學科，特別是心胸外科的研究重點。基因治療通過將基因導入機體并發(fā)揮作用，可以賦予心肌抗急性心肌損傷的能力，并且沒有手術帶給病人的二次打擊，必將為防治心肌急性損傷帶來新的曙光。 原癌基因是一類編碼關鍵性調控蛋白的正常細胞基因，在細胞的生存、生長、發(fā)育、分化過程中具有重要的生理功能，當原癌基因被激活有可能引起細胞生長過度活躍和/或細胞

3、死亡受抑制。凋亡是急性損傷過程中心肌細胞丟失造成心肌受損的重要原因。原癌基因的運用使受損的心肌組織得到有效的修復并達到逆轉心臟衰竭的目的。已有文獻報道，心肌的缺血性損傷，通過原癌基因src，ras，vav酪氨酸激酶所介導的途徑而得以修復，從而阻止了心力衰竭的發(fā)生。 原癌基因絲/蘇氨酸激酶Pim-3在結構上與Pim-1、Pim-2同屬Pim激酶家族。該家族各成員在激酶結構域上高度同源，其生物學功能也存在顯著的重疊。與其它絲/蘇氨酸

4、蛋白激酶如P13K-Akt、mTOR等一樣，Pim激酶家族能使在細胞生長通路中起關鍵作用的蛋白質分子內的絲/蘇氨酸殘基磷酸化，并通過不同于PI3K-Akt-mTOR的另一條通路，促進細胞的生存和繁殖。已證實多種生長因子、激素和細胞生長通路如JAK/STAT、P13K、Akt等可在不同水平介導Pim的表達。因此，Pim激酶在細胞生長的調控中起重要作用，并對細胞凋亡有明顯的抑制作用。有實驗證明，Pim-3基因在腦組織缺血損傷周圍出現(xiàn)早期高水

5、平的表達。在組織缺血早期，許多基因的表達被顯著抑制，但Pim-3基因表達則被早期誘導，提示它可能對細胞的生存和功能恢復有重要意義。受此啟發(fā)，本課題擬探討在心肌IRI時Pim-3基因是否具有抗凋亡和對心肌細胞生存具有保護作用。本工作的總體研究思路為： 首先，采用原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞，建立缺氧/復氧（anoxia/ reoxygenation，A/R）損傷及缺氧預適應（anoxia preconditioning，APC）保護模型

6、，在用多種經(jīng)典、公認的檢測方法確認已造成急性心肌損傷及保護作用的基礎上，采用分子生物學檢測方法，研究Pim-3 mRNA以及蛋白表達的變化規(guī)律。接著，構建Pim-3表達質粒，采用基因轉染技術處理心肌細胞。在確認Pim-3在細胞內高表達后，采用多種經(jīng)典、公認的檢測方法研究Pim-3在急性A/R損傷模型與APC保護模型的作用，闡明Pim-3基因表達在急性心肌細胞損傷時的意義。 然后，在明確Pim-3能對抗心肌A/R損傷的基礎上，選定

7、心肌細胞中一條重要的信號轉導通路MAPKs通路，MAPKs包括3種主要的亞家族：ERK1/2，JNK和p38 MAPK，研究究竟是哪一個或哪幾個MAPKs亞家族介導了心肌細胞急性損傷時Pim-3的表達。 最后，探討Pim-3對抗心肌急性A/R損傷的機制，從細胞凋亡的線粒體信號途徑入手，闡明Pim-3對抗心肌急性損傷，發(fā)揮保護作用的機制。 第一部分：Pim-3在心肌細胞急性A/R損傷時的表達及意義 心肌細胞凋亡是A

8、/R損傷的一個重要特征，APC是目前已知的最為強大的對抗A/R損傷的方法，研究證實，APC對抗A/R損傷的機制主要是上調一些內源性保護蛋白，這些蛋白能夠抑制心肌細胞的凋亡，從而發(fā)揮心肌保護作用。原癌基因絲/蘇氨酸激酶Pim-3在結構上與Pim-1、Pim-2同屬Pim激酶家族。大量的實驗研究已證實，Pim激酶的上調與細胞凋亡的抑制存在明顯的相關性。Pim-3基因在腦組織缺血損傷周圍出現(xiàn)早期高水平的表達，在組織缺血早期，許多基因的表達被顯

9、著抑制的情況下，Pim-3基因表達卻被誘導，表達上調，提示可能對細胞的生存和功能恢復有重要意義。因此，本研究采用原代培養(yǎng)新生大鼠的心肌細胞，建立A/R損傷、APC保護模型，結果顯示缺氧預適應能明顯增加Pim-3的表達，構建pcDNA3.1/ Pim-3基因表達質粒，轉染入心肌細胞，結果顯示外源性的Pim-3基因的導入能對抗A/R所致的急性損傷，發(fā)揮類似于缺氧預適應的保護作用。 第二部分：p38 MAPK通路介導Pim-3在心肌細

10、胞急性損傷時的表達 在前期實驗證實缺氧預適應能明顯增加Pim-3的表達，從而對抗心肌細胞的A/R損傷之后，在這一部分我們進一步探討了缺氧預適應中Pim-3表達上調所涉及的心肌細胞信號傳導通路。多項研究證明，MAPKs是缺血、缺氧、牽張、激素、生長因子和細胞因子等多種細胞外刺激誘導基因表達、細胞增殖等核反應的共同通路或匯聚點，多種細胞外刺激（包括缺血、應激、激素、細胞因子、生長因子等），無論是通過G蛋白或是酪氨酸蛋白激酶的活化，都

11、可激活Raf→MAPK激酶（MAPK kinase）→MAPK的磷酸化連鎖反應，經(jīng)過MAPK的核轉位，引起轉錄因子的磷酸化，調節(jié)原癌基因和應激蛋白基因的表達，促進有關蛋白質合成增加，完成對細胞外刺激的反應。MAPKs包括3種主要的亞家族：ERK1/2，JNK和p38 MAPK。引起ERK1/2激活的主要是生長因子等有絲分裂刺激，導致細胞增殖、分化等核反應；JNK and p38 MAPK則在缺血缺氧、應激、紫外線、細胞因子等刺激下被激活

12、，從而影響不同病理條件下細胞的生物學行為和組織器官的功能[8]。但是這三條通路在細胞中的確切作用還不是很清楚。在本實驗中，分別給予這三條通路的特異性阻斷劑阻斷由APC所誘導的活化，結果發(fā)現(xiàn)阻斷ERK1/2和JNK的活化對Pim-3的表達沒有明顯的影響，而阻斷了p38 MAPK的活化，Pim-3的表達則明顯下降，提示由APC所誘導的Pim-3的表達升高與p38 MAPK通路有關。 第三部分：細胞凋亡的線粒體信號通路在Pim-3抗心

13、肌急性損傷中的作用 本研究在證實Pim-3基因轉染入心肌細胞后，逆轉了A/R所致的心肌急性損傷的基礎上，對Pim-3基因產生心肌保護作用的機制進行探討。凋亡是心肌細胞A/R損傷過程中心肌細胞丟失造成心肌受損的重要原因，Pim-3作為原癌基因具有對抗凋亡的能力，我們推測Pim-3抗急性心肌損傷是通過抑制凋亡而起作用的。凋亡發(fā)生的分子生物學機制是相當復雜的，近年來，線粒體信號途徑介導的細胞凋亡機制研究倍受關注，認為凋亡過程中線粒體可

14、能起著中心調控作用，通過使mPTP過度開放，造成線粒體腫脹，外膜破裂，釋放CytC至胞漿中導致凋亡發(fā)生。本研究結果表明，心肌細胞在遭受A/R損傷時，線粒體滲透性轉換增大，CytC由線粒體向胞漿大量釋放，而Pim-3轉染組則明顯抑制了線粒體的腫脹，從而抑制了Cyt C由線粒體向胞漿的釋放，而且改善了心肌細胞的各項指標，起到了心肌保護作用。這些數(shù)據(jù)證明，mPTP的開放，細胞色素C從線粒體釋放至胞質是引發(fā)凋亡的關鍵步驟。當?shù)蛲龃碳ひ蜃右鸺毎?/p>