益氣活血法和補腎生髓法對體外培養(yǎng)和腦缺血大鼠神經干細胞增殖分化的影響.pdf

1、目的依據中醫(yī)腦髓學說、氣血相關理論和缺血性腦卒中“氣虛血瘀”病機學說，借助益氣活血法代表方腦絡欣通和補腎生髓法代表方左歸丸，比較觀察兩種不同中醫(yī)治法對誘導神經干細胞增殖、分化，以及神經營養(yǎng)因子表達水平的影響，從神經干細胞增殖、分化和調控角度探討不同中醫(yī)治法在修復缺血性腦損傷中的作用及其機制。 方法1分離E14胎鼠大腦皮質及皮質下組織，通過原代細胞培養(yǎng)、傳代、單細胞克隆和免疫細胞熒光化學方法，用神經干細胞的特異性巢蛋白單克隆抗體(

2、神經上皮干細胞蛋白Nestin)、增殖細胞單克隆抗體(5-溴脫氧尿苷嘧啶BrdU)、神經細胞的特異性抗體(神經元特異性烯醇化酶NSE、膠質纖維酸性蛋白GFAP、半乳糖腦苷脂Gal-C)鑒定神經干細胞的自我更新增殖能力和多向分化潛能。 2分別采用腦絡欣通藥物血清和左歸丸藥物血清培養(yǎng)大鼠胚胎神經干細胞，觀察其促增殖效應和誘導分化效應，應用相差顯微鏡和免疫熒光染色對其進行比較觀察。 3線栓法制作急性局灶性腦缺血再灌注損傷動物模

3、型，動物隨機分為假手術組、模型組、腦絡欣通組及左歸丸組4組。在相應時間點進行腦缺血范圍測定和神經缺損體征評分。在腦缺血再灌注1d、3d、7d后的3個不同時間點，應用免疫組織化學或免疫熒光化學技術，進行Nestin、BrdU單標染色及BrdU/GFAP、BrdU/NSE雙標染色，分析比較各組大鼠腦組織中陽性細胞的表達情況。 4線栓法制作急性局灶性腦缺血再灌注損傷動物模型，動物隨機分為假手術組、模型組、腦絡欣通組及左歸丸組4組。在腦

4、缺血再灌注1d、3d、7d后的3個不同時間點，應用免疫組織化學技術，進行腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)免疫組化顯色，在大鼠腦缺血后腦內有神經干細胞增生的相關區(qū)域，分析比較腦缺血后以及應用腦絡欣通和左歸丸后BDNF、bFGF的表達情況。 結果1從胎鼠大腦皮質及皮質下分離的組織，經原代和傳代培養(yǎng)均可形成細胞克隆，并具有增殖的能力，表達巢蛋白抗原和增殖細胞抗原；在血清誘導下，分化后的細胞表達3種神經

5、細胞(神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞)的特異性抗原。 2腦絡欣通藥物血清和左歸丸藥物血清均可誘導絕大多數神經干細胞分化成神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞；前者誘導干細胞分化的進程雖比后者要慢，但其分化的神經元在細胞形態(tài)學上與發(fā)育成熟的神經元更為接近。此外，兩者還能一定程度上促進培養(yǎng)的神經干細胞增殖，以后者促進神經干細胞增殖的效應較為顯著。 3腦絡欣通組和左歸丸組均能縮小大鼠腦缺血范圍，改善神經功能缺損體征，腦絡欣通

6、組作用強于左歸丸組。腦缺血再灌注損傷后，Nestin、BrdU在不同時間點、在缺血側的不同腦區(qū)出現程度不等的表達。與模型組比較，兩治療組Nestin、BrdU免疫陽性表達明顯增強，3d時左歸丸組促進Nestin、BrdU表達的作用較腦絡欣通組顯著，1d、7d時兩組作用無明顯差異。兩治療組在3d時可見少量BrdU/GFAP雙標陽性細胞，在7d時可見少量BrdU/NSE雙標陽性細胞，雙標陽性細胞率以腦絡欣通組為高。 4腦缺血再灌注損

7、傷后，在腦內有神經干細胞增殖的相關區(qū)域，BDNF表達范圍較廣泛，表達強度較強，表達峰值出現較晚；bFGF表達范圍較局限，表達強度較弱，表達峰值出現較早。與模型組比較，在給予腦絡欣通和左歸丸后，上述腦區(qū)內不同時間點BDNF、bFGF的表達數量明顯增多、反應明顯增強；兩治療組相比，前者促進BDNF表達上調的效應更為明顯，表達峰值出現較晚；后者以促進bFGF表達上調的效應顯著，其峰值出現較早。 結論腦絡欣通和左歸丸均能夠促進神經干細胞