ICAM-1介導的脈沖電刺激下血管內皮細胞與祖細胞粘附的實驗研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　 生物電是人體的固有屬性,伴隨著每個生命活動的完成；細胞是機體基本組成單位,細胞膜內外某些帶電離子分布和濃度不同以及細胞膜對不同離子的選擇通透性,正是細胞、組織形成跨膜電位的條件,也是生物電的起源。正常情況下,細胞間緊密連接的存在可使跨膜電位均等分布于相應組織當中,組織一旦損傷,完整的細胞間緊密連接不復存在,損傷處局部跨膜電位即被削弱,健側部位的高電勢和損傷病灶的低電勢隨即形成一內生電場。由于內生電場激活了

2、病變組織細胞及其周圍細胞修復信號的傳遞,可誘導機體產生損傷修復效應,因此,如何深化認識內生電場修復作用并加以利用則顯得十分重要。
　　 基于此背景,生物電刺激在血管再生領域中的應用已經(jīng)積累了一定的數(shù)據(jù),有關策略主要圍繞以下兩個方面:第一,外部施加生物電刺激直接促進機體內血管再生,相當于彌補并強化內生電場誘導產生的修復效應；第二,以構建組織工程化血管為中心,通過生物電刺激的干預,從排列、粘附和抗件等方面增強種子細胞與生物材料的整合

3、。由于血管內皮細胞覆蓋所有類型血管并密切接觸血流,同時也是新生血管形成的首要環(huán)節(jié),故目前電刺激研究多集中于血管內皮細胞功能學的改變。然而,研究表明僅僅依賴于血管內皮增殖或出芽等原位修復并不能滿足重建血管、改善血流的需要,內皮祖細胞(Endothelialprogenitor cell,EPC)的發(fā)生發(fā)展已被證實對成體血管再生有著不可替代的作用,新生血管形成的研究方向逐漸由傳統(tǒng)的血管形成過渡罕EPC介導的血管發(fā)生。那么EPC將如何參與到電

4、刺激促新生血管形成過程?該問題的探討十分有意義。
　　 隨著EPC探索的深入,EPC研究已由改良培養(yǎng)方法和分析增殖分化能力為主的策略演變?yōu)閷毎麣w巢信號的重點探索。EPC歸巢,指在缺血損傷的應激代償反應中,EPC因缺血部位趨化因子的誘導而產生動員和定向遷移,然后在血管內皮層上緩慢移動,繼而與血管內皮產生緊密粘附并完成跨內皮轉移,最后通過直接分化和分泌等形式來完成修復反應。經(jīng)證實,EPC與血管內皮之間的粘附在整個歸巢過程當中起著承

5、上啟下的作用,已知多對粘附分了組合參與此調節(jié)過程。其中細胞間粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule,ICAM-1)屬于免疫球蛋白超家族成員,其在血管內皮細胞膜上的表達不僅介導了細胞間的粘附,更重要的是通過這種結合,可將外界損傷刺激信號沿著EPC膜上配體整合素αvβ2,尤其是整合素β2,傳遞至EPC胞內,然后啟動后續(xù)生物學信號的轉導,在粘附分子調控的歸巢過程當中最為關鍵。那么血管內皮在適宜電刺激的調節(jié)

6、下能否增強自身與EPC的粘附?電刺激促進血管內皮捕獲循環(huán)EPC的機制又是否與ICAM-1的上調有關?國內外未見同類型報道,這是開展木課題研究的主要目的。
　　 為驗證我們的設想,本課題研究分為三個部分:
　　 (1)自主研制具有適合刺激形式的電刺激儀,獲得人臍靜脈內皮細胞(Humanumbilical vein endothelial cell,HUVEC)并建立細胞培養(yǎng)電刺激模型,首先評價電刺激下培養(yǎng)體系的穩(wěn)定性、HU

7、VEC形態(tài)學和增殖活性的改變；
　　 (2)誘導培養(yǎng)外周血EPC并進行鑒定,通過熒光標記EPC以衡量電刺激下HUVEC與EPC之間粘附強度的改變；
　　 (3)檢測電刺激下HUVEC ICAM-1的表達水平,以期探索電刺激影響HUVEC捕獲EPC的可能機制。
　　 方法
　　 (1)電刺激儀的研制與評價
　　 聯(lián)合生物醫(yī)學工程學院醫(yī)學工程系,自主研制脈沖輸出形式的電刺激儀；固定刺激脈寬和頻率為最大

8、值,伏安法檢測不同電壓幅度刺激下2h內培養(yǎng)液電阻,并且探測局部溫度的變化；
　　 (2)電刺激對HUVEC形態(tài)學以及增殖活性的影響
　　 膠原酶消化法分離HUVEC,結合形態(tài)學和Ⅶ因子相關抗原對其鑒定；將HUVEC分為不同參數(shù)刺激組和常規(guī)培養(yǎng)組,刺激24h后觀察HUVEC形態(tài)學變化,MTS法比較HUVEC增殖活性的差異；
　　 (3)電刺激對HUVEC與EPC之間粘附強度的影響
　　 密度梯度離心法分離外

9、周血單個核細胞,專用培養(yǎng)基直接誘導培養(yǎng)外周血EPC,于第9天進行免疫熒光鑒定(乙?；兔芏戎鞍缀颓G豆類凝集素)以及表面標志流式分析(CD34、CD133、CD31、VEGFR2和CD14)；
　　 取第9天EPC,活性熒光染料CFSE標記后接種在單層HUVEC上,不同參數(shù)電刺激培養(yǎng)24h,顯微鏡下觀察貼壁熒光標記EPC數(shù)量,熒光酶標儀讀取細胞熒光強度,以熒光比率衡量粘附強度。
　　 (4)電刺激對HUVEC ICAM-

10、1表達的影響
　　 24h培養(yǎng)結束后分別收集不同參數(shù)電刺激組和常規(guī)培養(yǎng)組細胞的總RNA,采用Real time PCR技術中的SYBR Green染料法,運用2-△△Ct法對各實驗組中HUVEC ICAM-1 mRNA相對表達量進行分析。
　　 (5)統(tǒng)計學方法:
　　 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差((x)±s)表示,表面標志陽性率比較采用配對t檢驗,多組間不同時間點電阻比較采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析,多組間溫度比較、熒光

11、比率比較采用完全隨機設計方差分析,多組間細胞增殖活性比較、基因表達量比較采用隨機區(qū)組設計的方差分析:方差齊時采用Fisher法,多重比較用Bonferroni法;方差不齊時則用Welch近似法,多重比較用Dunnett T3法,P<0.05視為具有顯著性差異,采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件計算。
　　 結論
　　 (1)成功研制出具有雙相脈沖輸出的電刺激儀,并且建立了相對穩(wěn)定的細胞培養(yǎng)刺激模型,在固定5V和5Hz的前提下,

12、HUVEC形態(tài)改變明顯,呈扁平長梭形伸展,但其增殖活性并不隨著刺激脈寬的延長(0、1、3、6、9ms)而改變;
　　 (2)成功從外周血單個核細胞中直接誘導培養(yǎng)出EPC,經(jīng)鑒定,細胞符合正在分化的早期EPC表型；
　　 (3)雙相脈沖電刺激在一定范圍內有利于HUVEC與EPC之間的粘附,其中以5V/5Hz/6ms組粘附增強最為顯著；
　　 (4)雙相脈沖電刺激可上調HUVEC ICAM-1 mRNA相對表達量,變

13、化規(guī)律與細胞間粘附實驗一致,同樣以5V/5Hz/6ms作用最顯著,提示HUVEC ICAM-1表達上調可能是電刺激促進HUVEC捕獲EPC的機制之一。
　　 創(chuàng)新點
　　 (1)前期研究中多采用直流電形式對HUVEC等血管內皮細胞進行干預,有關脈沖電刺激研究報道不多,本研究在國內外較早采用正負雙相脈沖形式對HUVEC進行干預,為電刺激下血管再生的體外研究提供新的實驗方法。
　　 (2)本研究首次將內皮祖細胞整合到