HCV E2與CD81結合對Raji細胞調節(jié)及干擾素α對人肝癌細胞信號轉導途徑的影響.pdf

1、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)是有包膜的單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科。HCV基因組長約9.6 kb，有一個開放閱讀框架，編碼的多聚蛋白前體在病毒和宿主蛋白酶的作用下形成結構蛋白(核心蛋白C以及糖基化的包膜蛋白E1、E2)和非結構蛋白(p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。全世界HCV感染者約1.7億，感染導致的慢性肝臟疾病是一個嚴重的全球性的公共衛(wèi)生難題，目前還沒有疫苗上市。HC

2、V兩條高度N-糖基化的糖蛋白E1、E2組成病毒體包膜蛋白并形成異二聚體，作為與宿主細胞受體互作的配體。
　　 一、丙型肝炎病毒E2蛋白結合CD81分子對Raji細胞激活的調節(jié)
　　 人CD81分子是HCV的細胞表面受體，可結合HCVE2蛋白。事實上HCV假病毒顆粒(HCVpp)，細胞培養(yǎng)的HCV(HCVcc)和所有血漿來源的HCV的感染性均源自與宿主表面CD81等受體分子的結合。CD81分子為四次跨膜素家族成員，有兩個胞

3、外環(huán)，分布于包括B、T淋巴細胞、NK細胞、肝細胞在內的多種細胞表面，與細胞的活化、增殖、粘附等生物學功能密切相關，尤其對于特異性免疫應答的誘導具有重要作用。在B細胞表面，由CD19-CD21-CD81(TAPA-1)-CD225(Leu-13)共同構成Ⅱ型補體受體復合物，該復合物與B細胞受體(BCR)共同參與B細胞活化的信號傳導。B細胞的激活需要BCR以及CD19-CD21-CD81-CD225復合物與抗原的雙重結合信號，其中，BCR與

4、抗原分子中的抗原決定簇結合，而CD19-CD21-CD81-CD225復合物則通過CD21與補體C3裂解片段C3d結合(抗原與C3d結合)。HCV E2蛋白與CD81分子的大胞外環(huán)結合，改變了B細胞激活的正常信號傳導通路，導致B細胞非特異性活化和免疫球蛋白基因的超突變。由于E2蛋白與CD81分子的結合，慢性HCV感染者體內的B細胞大部分為活化的表型，在干擾素治療應答者，隨著血清中HCV RNA水平的降低，外周血中激活的B細胞數量相應顯著

5、減少。由于HCV慢性感染與B細胞淋巴瘤及冷球蛋白血癥的高度相關性，可以推測這與E2蛋白經CD81分子異常激活B細胞可能有重要關系。HCV E2蛋白與人CD81分子的結合還能非特異性激活T淋巴細胞和下調T細胞表面的T細胞受體，這不利于HCV抗原特異性T細胞免疫應答的誘導，并與慢性HCV感染所致肝組織內大量非HCV抗原特異性T淋巴細胞浸潤造成的肝組織炎性損傷密切相關。此外，E2與人CD81分子的結合可抑制NK細胞的活化，抑制HCV感染后的立

6、早期非特異性抗病毒應答。
　　 HCV E2蛋白結合人或者黑猩猩CD81分子可導致B淋巴細胞非特異性激活和免疫球蛋白基因的超突變以及異常免疫球蛋白的大量分泌，顯然，這可能與HCV自然感染只能極其有限地誘導中和抗體應答以及天然結構的E2蛋白免疫黑猩猩只能誘導低水平中和抗體應答有重要關系。CD19-CD21-CD81-CD225復合物中，CD21與結合抗原的補體片段C3d結合，使CD19/CD21交聯，CD19胞漿區(qū)的酪氨酸殘基發(fā)生

7、磷酸化，起始胞內的信號傳遞。CD81分子在轉錄后水平調控CD19分子的表達和在胞膜的定位，CD81分子的交聯能引起B(yǎng)細胞的凝集。然而，HCV E2蛋白與CDB1分子結合對B細胞激活、增殖和分化的調控，以及導致特異性抗體應答抑制的分子機制尚不清楚。闡明這些問題，有助于進一步認識和揭示HCV慢性感染以及HCV感染引發(fā)B細胞淋巴瘤以及自身免疫性疾病的本質原因。
　　 HCV包膜E2蛋白與CD81分子結合可引起免疫細胞的胞內信號傳導通路

8、和細胞免疫功能的異常改變，本研究進一步探討HCV E2蛋白經CD81分子非特異性激活B細胞和抑制特異性免疫應答的分子機制。HCV E2蛋白和HCVcc與Raji細胞表面CD81結合后觸發(fā)IκBα的磷酸化，上調抗凋亡Bcl-2家族蛋白，增強對Raji細胞在Fas介導的凋亡中的保護。此外，E2-CD81相互作用可上調CD81和共刺激分子CD80和CD86的表達，下調補體受體CD21。本研究有助于進一步揭示HCV慢性感染以及HCV感染引發(fā)B細

9、胞淋巴增生紊亂以及延遲中和抗體出現的分子機制。
　　 1、CD81 RNA干擾和HCV E2質粒的構建及表達
　　 人CD81小干擾RNA(siRNA)表達質粒pGCsi-U6-CD81 siRNA5作為模板進行PCR擴增，獲得的siRNA表達體(siRNA expression cassette)被插入慢病毒載體pLenti6?；旌腺|粒共轉染HEK293T細胞，前者包括口炎病毒(VSV)糖蛋白表達質粒，HIV gag/

10、pol(pLP1)質粒，HIV rev(pLP2)質粒和含有CD81 siRNA表達體的pLenti6載體。48小時后收集含有慢病毒顆粒的上清，用0.45μm孔徑的濾膜過濾。包含CD81siRNA表達體的慢病毒轉導至Raji細胞，3天后再同法感染一次，流式細胞術檢測細胞表面表達的CD81。
　　 HCV1a型H77株截短型E2蛋白(aa364-661)DNA片段和突變的E2-W529/A(第529位色氨酸被置換成丙氨酸)分別插入

11、pCI-neo質粒。上述兩種表達質粒載體轉染至293T細胞，72小時后去除上清收集細胞進行裂解，裂解提取物中的重組蛋白用山羊抗E2多克隆抗體檢測。
　　 2、E2結合CHO和Raji細胞，E2包被和細胞刺激
　　 人CD81表達質粒和模擬載體分別轉染至CHO細胞，48小時后流式細胞術檢測表達的CD81及E2蛋白與轉染后的CHO、Raji細胞的結合情況。
　　 E2單抗H53用碳酸鹽緩沖液稀釋至10μg/ml,加至

12、96孔板或24孔板，靜置于4℃過夜，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，然后加入足量的RPMI1640完全培養(yǎng)基，37℃孵育30分鐘。轉染HCVE2表達質粒或模擬載體的293T細胞提取物加至96或24孔板中，37℃孵育60分鐘。包被的多孔板進一步用PBS沖洗，將培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基中的Raji細胞混勻，加至多孔板，按實驗需要進行不同時間段的培養(yǎng)。
　　 3、HCV假病毒顆粒制備和感染
　　 293T細胞共轉染編碼HCV包膜糖蛋

13、白，gag/pol(pLP1)和rev(pLP2)的表達載體與編碼熒光素酶的轉移載體。48小時后收集含有HCVpp的上清，用0.45μm孔徑的濾膜過濾，以備下一步感染用。其中使用到HCV包膜蛋白表達質粒有1a基因型H77株，1b基因型con-1株和2a基因型J6株。
　　 Huh7.5和Raji細胞作為靶細胞接種至96孔板，濃度為104個細胞/孔，37℃培養(yǎng)。每孔加入上述HCVpp上清50μl，培養(yǎng)5小時后棄上清，細胞用常規(guī)培養(yǎng)

14、基在37℃繼續(xù)培養(yǎng)72小時，棄上清，用PBS沖洗一次，每孔加50μl細胞裂解液進行裂解，然后檢測熒光素酶活性。
　　 4、蛋白質印跡法檢測
　　 將收集的細胞裂解物煮沸5分鐘，用濃度12.5％的含十二烷基磺酸鈉(SDS)的聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)進行電泳分離蛋白。將蛋白電轉移至硝酸纖維素膜，用不同的一抗、二抗分別處理后，再用增強化學發(fā)光法檢測其免疫反應性。
　　 二、干擾素α調節(jié)人肝癌細胞中MAPK和STAT1

15、信號轉導途徑
　　 干擾素(IFN)誘導的胞內信號轉導過程和其抗病毒效應有關，JAK-STAT通路在IFN誘導的信號轉導中起關鍵作用，IFN與細胞表面的特定受體結合后啟動該通路，IFN的抗病毒作用也主要由該通路調節(jié)。除了JAK-STAT通路外，其他一些信號轉導通路也可能在對IFN的調節(jié)過程中發(fā)揮重要作用。通過對干擾素α(IFN-α)刺激處理后的人肝癌細胞Huh7和HepG2中的MAPK和STAT1信號轉導通路進行檢測，我們發(fā)現I

16、FN-α可特異上調ERK的磷酸化水平，而對上游激酶MEK的磷酸化似乎無影響。我們同時還檢測到p38MAPK磷酸化輕度增加，SAPK/JNK的磷酸化顯著增強，下游的ATF-2磷酸化也增強了，這表明IFN-α對MAPK信號轉導通路中各級聯反應的信號分子有不同程度的上調作用。此外我們還發(fā)現IFN-α對STAT1的磷酸化有極大的增強作用，且IFN-α對MAPK信號轉導通路的調節(jié)在Huh7和HepG2細胞中有所不同。
　　 小結：

17、　　 1.HCV E2蛋白和HCVcc都可引起IκBα的磷酸化，并上調抗凋亡的Bcl-2家族蛋白的表達，增強Raji細胞對抗Fas-介導的細胞凋亡的能力。此外，這類刺激信號能上調CD81分子和其共刺激分子CD80和CD86，下調補體受體CD21。
　　 2.E2-CD81的結合是引發(fā)上述效應的基礎，因為在CD81沉默的Raji細胞對E2和HCVcc都不產生反應，且E2突變體E2-W529/A因其不能與CD81結合，對正常Raj

18、i細胞也產生不了刺激作用。
　　 3.E2-CD81結合可能是HCV感染導致B細胞淋巴增生紊亂和中和抗體水平低下的原因。
　　 4.IFN-α對MAPK信號轉導通路中各級聯反應的信號分子有不同程度的上調作用，對STAT1的磷酸化有極大的增強作用，并且對MAPK信號轉導通路的調節(jié)在Huh7和HepG2細胞中有所不同
　　 5.本研究有助于進一步揭示HCV慢性感染以及HCV感染引發(fā)B細胞淋巴增生紊亂以及延遲中和抗體出