組織因子siRNA納米粒抑制靜脈移植物內膜增生.pdf

1、第一部分、化學合成siRNA抑制大鼠血管平滑肌細胞TF基因表達。 目的：探討siRNA對大鼠血管平滑肌細胞組織因子基因沉默作用的可行性和有效性。 方法：設計并合成針對大鼠組織因子的25bp雙鏈siRNA分子。使用組織因子siRNA、對照siRNA轉染大鼠血管平滑肌細胞，同時設立空白對照組。熒光顯微鏡觀察轉染效率。PDGF-BB刺激血管平滑肌細胞后RT-PCR檢測組織因子mRNA表達，免疫印跡和免疫組化檢測組織因子蛋白表達

2、。 結果：siRNA成功轉染到血管平滑肌細胞，轉染效率約90±2.3％。三對候選siRNA篩選出基因抑制效率最高一對，與未轉染組相比，轉染24h組織因子mRNA 表達減少86±0.6％，轉染48h組織因子蛋白表達減少92±1.0％，同時免疫組化檢測TF 表達明顯減弱。 結論：RNA干擾能明顯下調大鼠血管平滑肌細胞組織因子表達。 第二部分、組織因子siRNA殼聚糖納米粒的制備及其特性。 目的：探討殼聚糖-組

3、織因子小干擾RNA(TFsiRNA)納米粒制備方法及其特征，并觀察體外基因沉默作用。 方法：采用三聚磷酸鈉(TPP)離子膠凝法制備殼聚糖-siRNA納米粒。檢測納米粒平均粒徑和zeta電位、載藥率、體外控釋效果，并分析血清穩(wěn)定性、體外生物活性及其細胞毒性。 結果：兩種納米粒平均粒徑小于400nm，粒徑大小主要取決于殼聚糖分子量及其濃度。殼聚糖與TPP質量比、酸堿度也影響粒徑大小。包封型納米粒siRNA 載藥率為100％。

4、高分子量殼聚糖納米粒控釋效果好。殼聚糖-TPP-TFsiRNA納米粒中的siRNA在5％血清孵育24h開始降解，60h完全降解；50％血清孵育6h保持完整，48h完全降解。CS-TPP-TFsiRNA納米?；虺聊饔每膳cLipofectamine2000 相比：包封型79±1.5％,吸附型62±5.9％。 結論：殼聚糖納米粒是一種安全有效siRNA轉運載體。 第三部分、大鼠靜脈移植物組織因子表達及其意義。 目的

5、：檢測靜脈移植物管壁組織因子表達變化及其意義。 方法：建立SD大鼠同側頸外靜脈－頸總動脈移植模型，分別于術后1、3、7、14、28天取材。對側頸外靜脈作為對照。免疫組化觀察管壁組織因子、增殖細胞核抗原表達，同時檢測標本蛋白抽提物組織因子凝血活性。使用計算機圖像分析系統(tǒng)分析內膜、中膜厚度。 結果：所有移植物血管外膜均有組織因子表達，早期移植物（術后1、3、7天）內膜、中膜組織因子表達明顯增加，晚期移植物（術后14、28天）

6、內膜、中膜無組織因子表達；對側對照靜脈內膜、中膜無組織因子表達。術后3天可以觀察到PCNA蛋白陽性表達，7天明顯增高，14天達到最高。對照組靜脈、早期和晚期靜脈移植物血管蛋白抽提物TF活性分別為0.28±0.02、0.29±0.04、0.28±0.04(U/mg)，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。移植物內膜在術后7、14、28天增生明顯，而中膜在術后14、28天增生明顯。 結論：不同時間點靜脈移植物管壁組織因子表達發(fā)生變化并與

7、新內膜增生相關。 第四部分：Atelocollagen介導siRNA局部作用抑制大鼠靜脈移植物內膜增生。 目的：評價局部應用組織因子siRNA抑制靜脈移植物內膜增生效果。 方法：建立SD大鼠頸靜脈-頸總動脈移植模型。使用Atelocollagen-siRNA 混合物涂抹于靜脈移植物周圍，檢測管壁BLOCK-iTTM 熒光寡核苷酸確認其穩(wěn)定性和轉染效率。免疫印跡和免疫組化檢測管壁TF蛋白表達，同時檢測管壁細胞增殖指

8、數(shù)，計算術后28天新生內膜厚度。 結果：靜脈移植物可觀察到BLOCK-iTTM綠色熒光并持續(xù)到術后7天。治療組使用Atelocollagen攜帶siRNA有效抑制管壁TF蛋白表達，細胞增殖指數(shù)減少，術后28天新生內膜厚度減少68±3.2％。 結論：非病毒載體Atelocollagen攜帶siRNA有效下調靜脈移植物TF表達抑制內膜增生，這為靜脈移植物狹窄基因治療提供新的有效工具。 第五部分：靜電紡絲血管外支架緩釋

9、siRNA納米粒抑制靜脈移植物內膜增生。 目的：評價PLGA/CS納米粒雜化超細纖維膜血管外支架緩釋組織因子小干擾RNA抑制靜脈移植物內膜增生的有效性。 方法：使用改進靜電紡絲技術制備PLGA/CS納米粒雜化超細纖維膜。氯仿溶解雜化膜PLGA后測量殼聚糖含量，檢測超細纖維膜吸水率。建立SD大鼠右頸外靜脈-頸總動脈間置移植模型，隨機分為5組：A組（PLGA/CS-TFsiRNA納米粒外支架組），B組（PLGA/CS-Ste

10、althTM RNAi陰性對照納米粒外支架組），C組（PLGA/CS空白納米粒外支架組），D組（PLGA外支架組），E組（無外支架組）。BLOCK-iTTM熒光寡核苷酸檢測靜脈移植物轉染。分別于術后1，3，7，14，28天取標本。免疫印跡和免疫組化檢測管壁組織因子蛋白表達，免疫組化檢測管壁增殖細胞核抗原表達，計算機圖像系統(tǒng)分析新生內膜厚度。 結果：通過調節(jié)靜電紡絲PLGA和殼聚糖納米粒溶液流量控制雜化膜中PLGA和殼聚糖含量。雜

11、化膜由于加入殼聚糖具有良好吸水性。術后12天靜脈移植物管壁可檢測BLOCK-iTTM熒光寡核苷酸綠色熒光。術后3、7天A組組織因子蛋白表達明顯低于其他組(P＜0.05)，術后14天A組增殖細胞核抗原表達明顯低于其他組(P＜0.01)，A組術后28天新生內膜厚度明顯低于未治療組(P＜0.01)。 結論：靜電紡絲制備PLGA/CS納米粒雜化超細纖維膜血管外支架緩釋組織因子siRNA能有效抑制大鼠靜脈移植物早期內膜增生，這將成為基因治