Galectin-9在結直腸癌中的表達及其在腫瘤轉移中作用機制的研究.pdf

1、目的： ①比較galectin-9在正常大腸上皮組織和結直腸癌組織的表達以及galectin-9的表達和結直腸癌臨床特征的關系。 ②研究galectin-9在大腸癌轉移過程中的作用機制及三種亞型(即galectin-9L，galectin-9M和galectin-9S)可能存在的功能差別。 方法： ①分別用real-timePCR和免疫組織化學染色的方法檢測20例正常大腸上皮組織和45例結直腸癌組織gal

2、ectin-9基因和蛋白的表達，比較galectin-9在正常大腸上皮組織和結直腸癌組織的差異表達并分析galectin-9的表達和結直腸癌臨床特征的關系。 ②用RT-PCR方法擴增galectin-9三種剪接體的全長片段，分別將片段連接到質粒載體pIRES2-EGFP上，經(jīng)測序證實插入片段正確后，載體轉染結腸癌LoVo細胞，再用RT-PCR和Westernblot方法證實轉染效果。 ③用RT-PCR和Westernbl

3、ot方法比較分別轉染galectin-9不同亞型真核表達載體后某些侵襲轉移相關分子如integrin-β1，E-cadherin，E-selectin，ICAM-1，CD44和MMP-9在LoVo細胞表達的變化。 ④觀察分別轉染galectin-9不同亞型對LoVo細胞-內(nèi)皮細胞體外粘附實驗、LoVo細胞-基質粘附實驗以及LoVo細胞體外侵襲實驗的影響。 ⑤篩選穩(wěn)定表達galectin-9不同亞型的LoVo細胞并進行相關

4、的體內(nèi)實驗。 結果： ①real-timePCR結果顯示20例正常結直腸上皮組織中galectin-9基因相對表達量為45.34±43.81，45例結直腸癌組織中galectin-9基因相對表達量為19.80±17.37，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.028)。免疫組織化學染色結果顯示，galectin-9在正常結直腸上皮組織中表達的陽性率為90％(18/20)，在結直腸癌組織中表達的陽性率為62％(28/45)，差異同樣

5、具有統(tǒng)計學意義(P=0.023)。galectin-9在基因和蛋白水平的低表達和結直腸癌的遠處轉移相關(P＜0.05)，和結直腸癌患者的年齡、性別、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、腫瘤分化程度、腫瘤分期及腫瘤部位無關。 ②成功構建galectin-9三種亞型的真核表達載體并轉染結腸癌細胞株LoVo細胞。RT-PCR和Westernblot方法證實LoVo細胞分別表達galectin-9三種亞型。 ③轉染galectin-9L后

6、LoVo細胞E-selectin表達降低，轉染galectin-9M或galectin-9S后LoVo細胞E-selectin表達升高，半定量結果顯示差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。分別轉染galectin-9不同亞型表達載體后，LoVo細胞integrin-βl，E-cadherin，ICAM-1，CD44和MMP-9的基因表達無變化。 ④轉染galectin-9M或galectin-9S后LoVo細胞與內(nèi)皮細胞體外黏附作

7、用增強。轉染空載體組和轉染galectin-9L組平均熒光強度分別為：0.90±0.20和0.94±0.24，轉染galectin-9M和galectin-9S組平均熒光強度分別為：1.60±0.11和1.45±0.13，后兩組與前兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。分別加入galectin-9抗體(10μg/ml)，E-selectin抗體(20μg/ml)和β-乳糖(30mM)后，各組間熒光強度差異無統(tǒng)計學意義。轉染gale

8、ctin-9各個亞型后LoVo細胞與Matrigel的黏附作用增強。轉染空載體組平均吸光度為0.74±0.04，轉染galectin-9L，galectin-9M和galectin-9S組平均吸光度分別為：1.14±0.12，1.12±0.10和1.15±0.13，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。加入galectin-9抗體(10μg/ml)或β-乳糖(30mM)后該黏附作用被抑制，但E-selectin抗體(20μg/ml)不能抑制

9、該作用。同時，轉染galectin-9L組和轉染galectin-9S組被β-乳糖抑制作用較轉染galectin-9M組更明顯(P＜0.05)。體外侵襲實驗未發(fā)現(xiàn)galectin-9三種亞型對LoVo細胞侵襲力有影響。 ⑤可篩選出穩(wěn)定表達galectin-9L的LoVo細胞，但無法篩選出穩(wěn)定表達galectin-9M或galectin-9S的LoVo細胞。流式細胞儀檢測提示轉染galectin-9M或galectin-9S的Lo

10、Vo細胞的晚期凋亡率/壞死率大于轉染galectin-9LLoVo細胞的晚期凋亡率/壞死率。 結論： ①galectin-9在結直腸癌中低表達，并且和結直腸癌的遠處轉移相關，有可能成為判斷結直腸癌患者預后的一種新型標志物和結直腸癌基因治療的潛在靶點，但其三種亞型在其中發(fā)揮的作用需進一步區(qū)分。 ②galectin-9不同亞型對LoVo細胞E-selectin的表達具有不同調(diào)節(jié)作用，即galectin-9L下調(diào)E-s

11、electin表達，galectin-9M和galectin-9S上調(diào)E-selectin表達。 ③galectin-9M或galectin-9S能促進LoVo細胞與內(nèi)皮細胞體外黏附，galectin-9L未表現(xiàn)出這種作用，可能和galectin-9M和galectin-9S上調(diào)E-selectin表達而galectin-9L下調(diào)E-selectin表達有關。 ④galectin-9三種亞型均能促進LoVo細胞與細胞外基