ST6Gal I siRNA與ASO對宮頸癌及結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響.pdf

1、腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的特征之一，也是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的主要原因。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是—個多階段復(fù)雜的過程，其中細(xì)胞表面糖復(fù)合物的異常表達(dá)特別是糖復(fù)合物末端的唾液酸化改變被認(rèn)為與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。α2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(ST6Gal I)可催化活化的唾液酸以α2,6-糖苷鍵的形式連接到細(xì)胞膜表面的N-乙酰乳糖胺上，成為腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)；(Extracellular matrix， ECM)之間相互識別的重要受體。在宮頸癌與結(jié)腸癌細(xì)胞中

2、，編碼ST6Gal I的基因均高表達(dá)，該基因的高表達(dá)被認(rèn)為是引起宮頸癌、結(jié)腸癌高侵襲力的主要原因之一。 反義核酸技術(shù)是根據(jù)核酸間的堿基互補(bǔ)原理，用生物合成或人工合成的互補(bǔ)反義核酸或其化學(xué)修飾物與細(xì)胞內(nèi)的特定核酸結(jié)合以抑制或封閉其表達(dá)。其中RNA干擾(RNA interference，RNAi)及反義寡聚脫氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide，ASO)技術(shù)是近年研究基因表達(dá)調(diào)控的兩種常用的熱點(diǎn)反義

3、核酸技術(shù)，均顯示出良好的應(yīng)用背景。 本研究通過探討靶向ST6Gal I 的小分子干擾RNA(small interfering RNA， siRNA)和與其相同及不同靶點(diǎn)的ASO聯(lián)合應(yīng)用，對宮頸癌HeLa細(xì)胞與結(jié)腸癌 SW480細(xì)胞的黏附和侵襲力的影響，以期為RNAi及ASO技術(shù)在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移中的機(jī)制和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法: (1) 設(shè)計(jì)并合成靶向ST6Gal I的siRNA及ASO，用脂質(zhì)體IJpofect

4、amine 2000包裹后轉(zhuǎn)染MeI_枷胞及SW480細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)設(shè)4個對照組：空白對照組、脂質(zhì)體對照組、非特異性siRNA組、非特異性ASO組及5個實(shí)驗(yàn)組：siRNA組、AS01組(與siRNA相同靶點(diǎn))、AS02組(與siRNA不同靶點(diǎn))、 siRNA+ASO<,1>組及siRNAl斗ASO<,2>組，用RT-PCR測定轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中 ST6Gal I mRNA表達(dá)水平。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠顯色， Gone Geni

5、us凝膠成像分析系統(tǒng)測定灰度值，以目的基因ST6Gal I與管家基因β-actin 灰度值的比值來反映ST6Gal I mRNA的表達(dá)量，比值越高說明目的基因表達(dá)越高。 (2)采用特異性識別唾液酸受體的異硫氰酸熒光素標(biāo)記的接骨木凝集素 (FITC-SNA)作用于各組細(xì)胞，‘通過流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞表面α2,6-唾液酸含量，以平均熒光強(qiáng)度(fluorescence intensity,，F(xiàn)I)表示細(xì)胞表面α2,6-唾液酸含

6、量，F(xiàn)I值越高，說明細(xì)胞表面α2,6-唾液酸含量越高；同時(shí)通過免疫熒光技術(shù)，在熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞表面α2,6-唾液酸的表達(dá)隋況。 (3)用CytoMatrix<'TM>細(xì)胞黏附試劑盒，檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞對ECM的黏附力。用490nm波長下測定的吸光度值即A<,490>值的高低表示細(xì)胞對ECM黏附力的大小，值越高說明細(xì)胞對ECM黏附力越高。 (4)用CytoMatdx<'TM>細(xì)胞侵襲分析試劑盒，檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞對

7、ECM的侵襲力。以穿膜細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞侵襲力的大小，穿膜細(xì)胞數(shù)越多表示細(xì)胞侵襲力越大。 結(jié)論： (1)ST6Gal I siRNA與ASO均可調(diào)低HeLa細(xì)胞及SW480細(xì)胞中ST6Cral I的mRNA表達(dá)水平。siRNA與不同靶點(diǎn)的ASO合用，下調(diào)HeLa細(xì)胞及SW480細(xì)胞中ST6Cral I的mRNA表達(dá)水平強(qiáng)于單獨(dú)應(yīng)用siRNA組，而與相同靶點(diǎn)的ASO合用，下調(diào)HeLa細(xì)胞及SW480細(xì)胞中ST6Gal I的mR

8、NA表達(dá)水平與單獨(dú)應(yīng)用siRNA組無明顯差異。 (2)ST6Gal I siRNA與ASO均可降低HeLa及SW480細(xì)胞表面α2，6-唾液酸含量。siRNA與不同靶點(diǎn)的ASO合用，降低HeLa細(xì)胞及SW480細(xì)胞表面α2，6-唾液酸含量強(qiáng)于單獨(dú)應(yīng)用siRNA組，而與相同靶點(diǎn)的ASO合用，降低HeLa細(xì)胞及SW480細(xì)胞表面α2,6-唾液酸含量與單獨(dú)應(yīng)用siRNA組無明顯差異。 (3)ST6Gal I siRNA與ASO

9、均可調(diào)低HeLa及SW480細(xì)胞對ECM的黏附力。siRNA與不同靶點(diǎn)的ASO合用，調(diào)低HeLa細(xì)胞及SW480細(xì)胞對ECM黏附力的作用強(qiáng)于單獨(dú)應(yīng)用siRNA組，而與相同靶點(diǎn)的ASO合用，調(diào)低HeLa細(xì)胞及SW480細(xì)胞對ECM黏附力的作用與單獨(dú)應(yīng)用siRNA組無明顯差異。 (4)ST6Gal I siRNA與ASO均可調(diào)低HeLa及SW480細(xì)胞對ECM的侵襲力。siRNA與不同靶點(diǎn)的ASO合用，調(diào)低HeLa細(xì)胞及SW480細(xì)