乙型肝炎病毒C基因熱點變異與細胞毒性T淋巴細胞應答的體外研究.pdf

1、HBV是一種嗜肝DNA病毒，部分雙鏈環(huán)狀，大約由3200個堿基對組成，含有四個部分重疊的開放讀框，編碼外膜蛋白[前-S1，前S2和HBV表面抗原(hepatitisBvirussurfaceantigen，HBsAg)]、核殼蛋白[HBV核心抗原(hepatitisBviruscoreantigen，HBcAg)，e抗原(hepatitisBviruseantigen，HBeAg)]、轉式激活蛋白(X)和多聚酶蛋白(P)。宿主感染HBV

2、可能有幾種不同的臨床過程和結果，包括急性自限性肝炎、暴發(fā)性肝炎、慢性活動性肝炎(CAH)、肝硬化、急性加重的肝衰竭和無癥狀健康攜帶者(AsC)。HBV非直接致細胞病變，HBV感染者肝損傷是由于免疫應答介導的。 細胞毒T淋巴細胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)在機體抵抗各類病毒感染和/或導致免疫病理損傷中起著極為重要的作用，HBVC基因編碼183-185個氨基酸的核殼蛋白，含有抗原特異性CTL識別表位，當HBc

3、Ag多肽表達在肝細胞膜表面時，誘導的細胞免疫應答對于殺傷病毒感染的肝細胞起到至關重要的作用。 HBV是高度變異的，野生病毒在復制過程中為適應環(huán)境改變，?？砂l(fā)生基因差異或基因變異，形成毒株群體的異質性。HBcAg的第48-60、84-101和147-155位氨基酸序列是CTL識別的表位，常出現(xiàn)聚集變異，常見的是AA60的亮氨酸被纈氨酸替代(L60V)、AA87的絲氨酸被甘氨酸替代(S87G)和AA97的異亮氨酸被亮氨酸替代(I97

4、L)。病毒變異甚至抗原表位上單個氨基酸的替代就能抑制其與HLA的結合、或者減弱T細胞受體(TCR)對抗原肽的識別，進而影響CTL應答。變異熱點聚集于某一區(qū)段，提示該區(qū)段可能會發(fā)生相應功能的改變，產(chǎn)生與野生型不同的生物學效應。 如果要研究HBV特異性CTL活性，必須在體外用HLA相容的轉染體穩(wěn)定刺激增殖HBV特異性的CTL，建立穩(wěn)定的CTL刺激細胞和靶細胞系統(tǒng)。急、慢性HBV感染者病人的外周血中HBV特異性CTL前體數(shù)量太低，不能

5、直接被檢測到；而且HBV不能在體外直接感染，產(chǎn)生表達HBV基因產(chǎn)物的刺激細胞和靶細胞受HLA抗原限制，必須通過高效率的基因轉染方法獲得。因此，我們用定點突變的方法將攜帶1.2拷貝的HBV(adr亞型)全基因組的p3.8Ⅱ質粒C基因區(qū)進行突變，插入EBO-plpp真核細胞表達載體，轉染慢性HBV感染者EBV永生化的B淋巴母細胞系，經(jīng)潮霉素篩選后能穩(wěn)定表達，用于分析慢性HBV感染C基因變異對CTL應答的影響，以了解慢性HBV感染過程中病毒清

6、除和肝細胞損傷中的作用機制。 第一部分慢性乙型肝炎感染者EBV轉化的B淋巴母細胞系建立 EpsteinBarr病毒(EBV)是一種廣泛存在的人類皰疹病毒，在體外能夠高效率感染外周血中靜止的B淋巴細胞，使其永生化成為有增殖能力的B淋巴母細胞系(LCLs)，將HBV特異性抗原編碼的重組質粒轉染到LCLs中穩(wěn)定表達，由于能夠分裂增殖、易傳代和長期培養(yǎng)，為體外進行免疫學和遺傳學研究提供了良好的細胞來源。 1.PBMC采集

7、和EpsteinBarr病毒的制備 血清學確診的慢性HBV感染者46例(CAH31例，AsC15例)，無菌采集外周靜脈血30ml，肝素抗凝，等體積PBS稀釋混勻；淋巴細胞分離液lymphoprepTM密度梯度分離，收集中間層乳白色混懸液為外周血單個核細胞(PBMC)層，細胞計數(shù)后備用。 將產(chǎn)生EBV的B95-8細胞密度調(diào)整為1×106個/ml，用10ml的完全RPMI-1640培養(yǎng)基(10％胎牛血清)，移入培養(yǎng)瓶中，37

8、℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)期間不需更換和補充培養(yǎng)液，12～14d后離心收集細胞，反復凍融，使細胞裂解后收集培養(yǎng)上清，此時上清中可含有高滴度的EB病毒，液氮中儲存?zhèn)溆谩?2.建立永生化的B淋巴母細胞系 用1mlEBV上清感染1×106個PBMC，加入含有2μg/mlCyA，2.5μg/mlCpG的完全RPMI-1640培養(yǎng)液，定期按1∶1體積半換液，3～4周后即可獲得無限生長的細胞系LCLs，永生化的LCLs細胞形態(tài)

9、呈母細胞樣改變，體積增大，胞質豐富，呈球狀，增殖的細胞集落，懸浮或貼壁生長。利用流式細胞術檢測LCLs細胞表面標志CD19和CD23。表達CD19和CD23分子陽性細胞分別為94±2.7和90.2±4.7(％，X±SDn=42)。CD19是所有B細胞共有的表面標志，B細胞活化后亦不消失；CD23主要存在于激活的B細胞表面，是B細胞活化的標志，可根據(jù)B細胞表面CD23表達與否來判斷B細胞能否在體外長期培養(yǎng)。46例PBMC中，42例LCLs

10、轉化成功，成功率為91.3％。凍存和復蘇后增殖活性、細胞形態(tài)和生物學特性未改變。 第二部分乙型肝炎病毒全基因組C區(qū)突變株在B淋巴母細胞系中穩(wěn)定表達 在慢性HBV感染中，C基因的變異大部分多數(shù)集中在AA48-60、AA84-101和AA147-155的3個小段序列的聚集變異，比其它部位有較高的替代率。我國的慢性乙型肝炎病人常在這些區(qū)段出現(xiàn)變異。在這些聚集變異中，更常見的是常見的是AA60的亮氨酸被纈氨酸替代(L60V)、A

11、A87的絲氨酸被甘氨酸替代(S87G)和AA97的異亮氨酸被亮氨酸替代(I97L)，HBcAg在關鍵位置上個別核苷酸的點突變造成的錯義變異，可影響病毒的復制和病毒蛋白的表達，產(chǎn)生與野生型不同的生物學效應。本文采用定點突變和基因重組技術構建含1.2拷貝的HBV(adr亞型)全基因組L60V、S87G、I97L突變質粒真核表達載體，轉染病人自體永生化的LCLs，并穩(wěn)定表達，為研究HBVC基因熱點變異的生物學意義提供實驗基礎。

12、 第三部分乙型肝炎病毒核心區(qū)熱點變異與CTL應答的體外研究 一系列的研究表明，肝細胞的損傷是由于HBV介導的免疫應答引起的，HLA-Ⅰ類分子限制的CTL應答是清除HBV感染的決定因素。本研究用EBO-HBV全基因組C基因突變株質粒，轉染自體永生化LCLs，作為分析CTL細胞毒性的刺激細胞和靶細胞，體外誘導病人PBMC中的CTL，分析9例CAH病人和5例AsC病人在相同的HLA背景下，HBV野生株和變異株特異性的CTL應答作用。