NOD蛋白在煙曲霉感染小鼠肺組織中的表達及對煙曲霉孢子的識別機制.pdf

1、煙曲霉(Af)是目前最常見的空氣傳播的真菌感染病原體，可導致免疫受損患者發(fā)生嚴重且往往是致死性的侵襲性肺曲霉病(IPA)。隨著免疫受損患者的增多，IPA發(fā)病率顯著增加，已成為目前免疫受損患者最常見的肺部感染性疾病之一。在過去的十余年中，盡管不斷有新的抗真菌藥物問世，但由于IPA早期診斷困難且病情進展迅速，其病死率仍居高不下。故開展機體抵御煙曲霉感染的免疫反應機制研究，探索預防和治療煙曲霉感染的新措施，對于降低IPA發(fā)病率和病死率具有十分

2、重要的意義。 先天性免疫系統(tǒng)是機體識別、抵御病原體感染的第一道防線，它通過模式識別受體(patternrecognitionreceptors，PRRs)來迅速識別病原體。目前研究最多的PRRs為Toll樣受體(tol卜¨kereceptors，TLRs)，已被證實與抗煙曲霉感染免疫反應有關。另一類PRRs是近年來才發(fā)現(xiàn)的核苷酸結合寡聚化結構域(nucleotide—bindingo¨gomerizationdomain，NOD

3、)蛋白。NOD蛋白為胞漿內蛋白，目前認為它們與識別細胞內病原體有關。已知的NOD蛋白家族成員有20余種，其中最為重要的是NODl和NOD2。NODl又稱CARD(caspaserecruitmentdomain)一4蛋白，在全身各種組織細胞中都有分布，識別主要存在于革蘭陰性菌中的肽聚糖(PGN)的降解產物GM-triDAP。NOD2又稱CARDl5，分布主要局限于上皮細胞和抗原呈遞細胞(APCs)，識別的最小基序為胞壁酰二肽(MDP)。

4、MDP同時存在于革蘭陰性和陽性細菌胞壁PGN的降解產物中。盡管NODl和NOD2識別的配體不同，但它們都是通過受體相互作用蛋白2(receptor-interactingprotein2，RIP2)來激活NF-KB信號通路，促進一系列細胞因子的合成。已經證實NOD蛋白與多種細菌感染免疫反應有關。 煙曲霉孢子通過空氣傳播，由于其體積小，可順利進入下呼吸道，當條件適宜生長時便出芽形成菌絲，侵襲組織細胞，造成組織損傷。肺上皮細胞及肺泡

5、巨噬細胞作為肺部先天性免疫的主要組成細胞，能夠吞噬、殺滅煙曲霉孢子，釋放出一系列炎癥細胞因子，在抵御煙曲霉感染中發(fā)揮重要作用。已有研究表明PRRs在先天性免疫系統(tǒng)占有重要地位，但迄今為止NOD蛋白在肺組織中的表達僅有少量研究報道，尚未見NOD蛋白在抗煙曲霉感染免疫反應中作用的研究報道。鑒于煙曲霉系胞內感染病原體，我們假設NOD蛋白可能為煙曲霉的胞漿內PRRs。本研究通過建立煙曲霉肺部感染小鼠模型及A549、THPl細胞的培養(yǎng)來研究肺組織

6、中NOD相關蛋白的表達及對煙曲霉孢子的識別機制。 第一部分NOD相關蛋白在煙曲霉感染小鼠肺組織中的表達 目的：觀察NOD相關蛋白在煙曲霉感染小鼠肺部組織中的表達。方法：60只雄性BALB／c小鼠隨機分成2組，每組30只。通過經鼻滴入煙曲霉孢子的方法建立煙曲霉肺部感染小鼠模型，對照組小鼠經鼻滴入等量的生理鹽水。分別在感染前(卟)、感染后6h、12h、24h、48h觀察肺部煙曲霉負荷及病理學改變。采用RT-PCR方法檢測各時

7、間點的NODl、NOD2及RIP2mRNA在肺組織中的表達。采用免疫組化的方法檢測各時間點兩組小鼠肺組織NOD2蛋白的表達。結果：(1)感染組小鼠肺部煙曲霉負荷24h達最高峰，48h迅速下降。(2)兩組小鼠肺組織均表現(xiàn)為支氣管肺泡炎癥為主的病理改變。感染組小鼠24h炎癥反應最顯著，48h減輕。對照組小鼠病理損害明顯輕于感染組。(3)接種煙曲霉前(0h)、后6h、12h、24h、48hNODlmRNA表達量分別為0．34±0．05、0．4

8、l±0．08、O．46±0．07、0．47±0．04、0．47±0．48；NOD2mRNA表達量分別為0．30±0.00、O．36±0．06、0．45±0．10、0．60±O.00、0．73±0．08：RIP2mRNA表達量分別為0．44±0．10、O．56±O．09、O．62±0．07、0．64±0．07、0．63±0．06。感染后12h、24h、48hNODl、NOD2、RIP2mRNA表達上調，同感染前(0h)相比有顯著差異(P<

9、O．05)。NOD2mRNA的表達上調比NODl更加明顯。對照組各時間點NODl、NOD2、RIP2mRNA表達無顯著差異。感染組和對照組比較除0h、6h外各時間點NODl、RIP2mRNA表達均有顯著差異(P<0．05)。除0h外兩組各時間點NOD2mRNA表達有顯著差異(P

10、189．58、163854．4±17185．61、341363．9±35102．07、289¨4．5±38424．35，24hNOD2蛋白表達同0h相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0．05)。對照組各時間點NOD2蛋白表達無顯著差異。感染組、對照組組間比較24h、48hNOD2蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義(P

11、可能參與了抗煙曲霉肺部感染的免疫反應。 第二部分A549、THPl細胞中NOD2蛋白的表達與煙曲霉孢子刺激及TNF-α分泌的相關性研究 目的：觀察滅活煙曲霉孢子刺激人肺泡上皮細胞株A549及人單核／吞噬細胞株THPl后細胞中NOD2蛋白和NOD2蛋白的下游物RIP2激酶的表達，以及MDP對Af孢子刺激上述細胞分泌TNF—a的影響，探討NOD2蛋白在機體抗煙曲霉感染免疫反應中的作用。方法：(1)透射電鏡觀察A549、THP

12、l細胞與煙曲霉孢子孵育10h、24h、48h后細胞及胞漿內孢子的形態(tài)。(2)Real-timePCR檢測A549、THPl細胞在煙曲霉孢子刺激前(Oh)、后24h、48hNOD2、RIP2、TNF-amRNA表達。(3)Real-timePCR檢測不同刺激強度的煙曲霉孢子刺激A549、THPl細胞后NOD2mRNA表達。(4)免疫熒光法觀察煙曲霉孢子刺激A549細胞后NOD2蛋白的表達。(5)采用免疫沉降后westernblot的方法檢

13、測不同刺激強度的煙曲霉孢子刺激A549、THPl細胞后NOD2蛋白的表達。(6)ELISA法檢測煙曲霉孢子單獨和聯(lián)合NOD2的特異性配體MDP刺激A549、THPl細胞后TNF-α的分泌。結果：(1)煙曲霉孢子與A549、THPl孵育10h后胞漿內即可見到吞噬的孢子，24h時溶酶體內可見到部分消化狀態(tài)的煙曲霉孢子。(2)A549、THPl細胞在煙曲霉孢子刺激后24hNOD2、RIP2、TNF-QmRNA表達明顯上調，與0h比較差異有統(tǒng)計

14、學意義(P<0．05)。48hNOD2、RIP2、TNF-QmRNA表達均減少。(3)煙曲霉孢子刺激A549、THPl細胞后NOD2mRNA表達水平隨刺激強度的增加而上調，各組間表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0．05)。(4)免疫熒光法可見煙曲霉孢子刺激后NOD2蛋白表達增加。(5)煙曲霉孢子刺激A549、THPl細胞后NOD2蛋白的表達增加，不同刺激強度組間差異有統(tǒng)計學意義(P

15、單獨刺激、煙曲霉孢子聯(lián)合MDP刺激組4組A549細胞培養(yǎng)液中TNF-a含量分別為10．46±0．70、¨．36±1．20、12．63±2．76、13．94±3．42pg／ml；4組THPl細胞培養(yǎng)液中TNF-a含量分別為27．40±5．72、27．93±9．¨、32．63±4．71、82．13±10．76pg／ml。MDP能夠顯著增加煙曲霉孢子刺激后細胞TNF-a的分泌(P