自吞噬途徑在polyQ擴展突變型ataxin-3降解及SCA3-MJD發(fā)病機制中的作用Ataxin-3多克隆抗體的制備.pdf

1、背景：
　　 遺傳性脊髓小腦型共濟失調(spinocerebellar ataxia，SCAs)是一組以神經細胞變性為病理特征的神經系統遺傳疾病，目前認為其發(fā)病機制與致病基因外顯子中CAG拷貝數異常擴增產生帶有多聚谷氨酰胺(polyQ)鏈的蛋白有關。脊髓小腦型共濟失調三型/馬查多-約瑟夫病(spinocerebellar ataxia3/Machado-Joseph disease，SCA3/MJD)是SCAs中發(fā)病率較高的亞型

2、，其發(fā)病是由于致病基因MJD1編碼區(qū)內3’端的CAG重復序列異常擴增導致其編碼產物ataxin-3蛋白的羧基端多聚谷氨酰胺(polyglutamine，polyQ)肽鏈異常擴展引起。Ataxin-3蛋白的生理功能目前還不明確，其羧基端polyQ肽鏈異常擴展導致疾病發(fā)生的具體機制還不清楚。研究發(fā)現，致病蛋白的降解在此類疾病的發(fā)病機制中具有重要的意義。
　　 細胞內蛋白主要通過泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin—proteaso

3、mepathway，UPP)和自吞噬途徑(Autophagy)進行降解。其中自吞噬途徑在降解清除細胞自身大分子蛋白復合物和衰老細胞器，維持細胞內環(huán)境穩(wěn)定的過程中起著非常重要的作用，同時也是細胞適應外界環(huán)境變化的一種重要機制。目前研究提示，自吞噬途徑參與降解阿爾茨海默病、多聚谷氨酸疾病(SCA1、Huntingtin病)、帕金森病等多種神經系統變性疾病相關的致病蛋白并參與其生理及發(fā)病過程。
　　 參與調節(jié)自吞噬途徑的信號分子種類繁

4、多，其具體調節(jié)機制仍不清楚?，F在已經證實的是mTOR(mammalian target of rapamycin)對于自吞噬信號轉導途徑的負性調節(jié)作用。近年來在對mTOR信號通路眾多上游調節(jié)蛋白的研究中，LKB1-AMPK途徑受到了廣泛關注。目前認為LKB1是AMPK(AMP-activated protein kinase)重要的蛋白激酶，它能通過磷酸化AMPK第172位蘇氨酸(Thr172)使之活化進而參與調節(jié)mTOR。亦有報道顯示

5、，LXB1-AMPK途徑能通過介導細胞周期依賴性蛋白激酶抑制物p27kip1的磷酸化而直接參與調節(jié)自吞噬途徑。
　　 在前期研究中，我們構建了野生型ataxin-3蛋白和polyQ異常擴展突變型ataxin-3蛋白的真核表達載體：pCDNA3.1-Myc-His(-)B-ataxin-3—20Q和pCDNA3.1-Myc-His(-)B-ataxin-3-68Q。
　　 目的：
　　 擬開展自吞噬途徑對于poly

6、Q擴展突變型ataxin-3蛋白的降解、胞內聚合物形成、細胞活性影響的研究，以期較全面的探討其在SCA3/MJD發(fā)病機制中的作用；進一步研究自吞噬途徑可能的上游激酶LKB1能否通過自吞噬途徑參與調節(jié)polyQ擴展突變型ataxin-3蛋白的降解。
　　 方法：
　　 1、應用免疫熒光-激光共聚焦技術、Western印跡技術明確自吞噬途徑是否參與polyQ擴展突變型ataxin-3蛋白的降解；
　　 2、應用Wes

7、tern印跡技術研究LXB1是否參與polyQ擴展突變型ataxin-3蛋白的降解；
　　 3、應用免疫熒光-激光共聚焦技術、MTT法探討自吞噬途徑對polyQ擴展突變型ataxin-3蛋白細胞毒性的調節(jié)作用；
　　 4、應用重組基因技術、Western-blot技術構建并檢測野生型ataxin-3的pGEX-4T-2原核表達載體并誘導其表達；
　　 5、應用親和層析技術純化融合蛋白，免疫新西蘭兔制備了高效價的a

8、taxin-3多克隆抗體；
　　 結果：
　　 1、免疫熒光-激光共聚焦結果顯示：共轉pCDNA3.1-Myc-His(B)-ataxin-3—68Q和pEGFP-Cl-LC3細胞組中可見過表達的LC3與突變ataxin-3形成的胞內蛋白聚合體明顯重疊。Western-blot實驗結果顯示：分別經3-MA、NH4CL處理的細胞，ataxin-3-68Q條帶明顯增粗加深，而轉染后9小時加入rapamycin處理細胞后則at

9、axin-3—68Q條帶變淺，這說明polyQ擴展突變型ataxin-3能夠被自吞噬小體識別并包被，自吞噬途徑參與ataxin-3-68Q的降解，抑制或早期促進自吞噬途徑能有效減少或增加突變蛋白的降解。
　　 2、Western—blot結果發(fā)現LKB1的表達能抑制轉染細胞內polyQ異常擴展突變型ataxin-3的降解。
　　 3、免疫熒光結果顯示：3-MA處理組表達ataxin-3-68Q的細胞內可見大量的胞內蛋白聚

10、合物的形成，從形態(tài)學上分析，聚合物不僅數量增多而且形態(tài)更大，大部分聚集在胞核周圍；轉染后9小時加入rapamycin處理組細胞中，ataxin-3-68Q形成的胞內聚合物則明顯減少。進一步說明抑制自吞噬途徑能增加細胞內ataxin-3-68Q蛋白聚合體的形成，反之亦然。經rapamycin處理的兩組細胞中，轉染后早期(9小時)處理組較對照組中ataxin-3-68Q表達減少，但轉染后晚期(16小時)處理組目標蛋白表達變化不大。這說明在突

11、變蛋白表達早期激活胞內自噬水平能加快聚合物的降解清除。
　　 4、MTT分析結果顯示，與ataxin-3-68Q對照組比較：3-MA組組聚合體陽性細胞數明顯增加，細胞活性降低(P<0.05)；轉染后9小時加入rapamycin組聚合體陽性細胞數明顯減少，細胞活性有所增加(P<0.005)；轉染后16小時加入rapamycin組，聚合體陽性細胞數差異無統計學意義(P>0.05)，細胞活性反而降低(P<0.01)。
　　 5

12、、DNA測序證實所構建的野生型ataxin-3氨基端的原核表達載體的目的基因位點均與ataxin-3在GenBank中的標準序列(S75313)完全匹配。核對各載體的閱讀框在插入目的基因序列后均無移碼，說明原核表達載體構建成功。
　　 6、Western-blot、免疫熒光結果均證實制備的多克隆抗體能夠識別ataxin-3蛋白，具有較高特異性。
　　 結論：
　　 1證實自吞噬途徑參與細胞內polyQ異常擴展突變

13、型ataxin-3蛋白的降解；
　　 2發(fā)現抑制或早期刺激自吞噬途徑能分別抑制或促進胞內polyQ擴展突變型ataxin-3蛋白的降解；
　　 3首次發(fā)現LKB1的表達抑制polyQ擴展突變型ataxin-3蛋白的降解；
　　 4證實自吞噬途徑能促進polyQ擴展突變型ataxin-3蛋白的降解，減少胞內聚合體的形成，減輕細胞毒性；
　　 5制備了ataxin-3-N蛋白特異性抗體，可用于進一步研究其相關