殼聚糖-膠原蛋白與蛋白質和細胞的相互作用研究.pdf

1、生物相容性評價是生物材料領域的關鍵科學問題之一，而細胞與材料的相互作用和蛋白質與材料的相互作用一直是生物相容性研究的兩大主題。普遍認為生物材料植入人體后立即引起血液和細胞間液蛋白質的吸附，然后通過蛋白質吸附層介導細胞與材料之間的反應。因此，為了更加深入的理解材料與細胞的相互作用機制，需要對材料表面蛋白質吸附進行全面深入的研究。
　　 本論文的目的是采用蛋白質組學技術結合生物信息學分析的方法，研究血清蛋白質在殼聚糖膜和膠原蛋白/殼

2、聚糖混合膜表面的整體吸附情況，并結合細胞在兩種材料表面的粘附和生長情況，對吸附蛋白質在介導細胞與材料反應中的作用進行初步的探討，為系統(tǒng)全面地研究蛋白質吸附差異所導致的細胞行為差異機制打下基礎。
　　 本論文的具體工作如下:
　　 1.采用勻膠法制備殼聚糖膜和膠原蛋白/殼聚糖膜，對殼聚糖膜進行了臺階儀、掃描電子顯微鏡(SEM)和X射線能量散射譜分析(EDS)的表征，篩選出了殼聚糖膜制備最佳濃度;對兩種材料進行了接觸角、紅外

3、光譜和原子力顯微鏡(AFM)的表征。結果表明，膠原蛋白/殼聚糖膜比殼聚糖膜有更好的親水性;在膠原蛋白/殼聚糖膜中，膠原蛋白分子與殼聚糖分子間形成了氫鍵;膠原蛋白/殼聚糖膜表面粗糙度大于殼聚糖膜表面。
　　 2.觀察了PC12細胞在有/無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下在殼聚糖膜、膠原蛋白/殼聚糖膜和正常對照表面粘附和鋪展情況的差異，結果顯示，正常培養(yǎng)（含血清）4小時后，殼聚糖膜、膠原蛋白/殼聚糖膜和正常對照表面PC12細胞均有粘附，多數細胞

4、鋪展良好，細胞多呈梭性和多角形，其中殼聚糖膜表面細胞鋪展數目較少。而采用不含血清培養(yǎng)液培養(yǎng)4小時后，三種材料表面PC12細胞均為圓球形，沒有很好的鋪展，說明血清對于PC12細胞的鋪展是必要的。
　　 3.采用MTT法測定了PC12細胞在殼聚糖膜和膠原蛋白/殼聚糖膜表面培養(yǎng)24h、48h和72h后的增殖率，實驗結果表明，膠原蛋白/殼聚糖膜表面PC12細胞增殖率明顯大于殼聚糖膜表面;前者細胞增殖率隨培養(yǎng)時間延長變化不大，而后者細胞增

5、殖率呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢。說明相對于單純的殼聚糖膜而言，膠原蛋白/殼聚糖膜可以明顯促進PC12細胞的生長和增殖。
　　 4.采用SDS-PAGE+質譜分析的蛋白質組學技術分別鑒定了兩種材料表面吸附的血清蛋白種類信息，并計算了每種蛋白質的相對豐度，進一步利用同位素標記的方法研究兩種材料表面各種血清蛋白質吸附量的差異。殼聚糖膜表面鑒定的蛋白質為104種，膠原蛋白/殼聚糖膜表面鑒定的蛋白質為98種，兩種材料表面均有吸附的蛋白質為78

6、種;同位素標記蛋白質組學鑒定實驗共檢測到46種蛋白質。
　　 5.采用DAVID功能注釋工具對所有鑒定到的蛋白質進行GO功能分類分析、蛋白質功能分析和生物學途徑分析。GO功能分類分析結果表明蛋白質主要包含的功能類別有生物學過程調控、應激、生物質量調控、蛋白質結合、酶抑制活性、離子結合、脂質結合、胞外空間、胞外區(qū)等。蛋白質功能分析結果中蛋白質涉及了26種功能類別，主要包括分泌、信號和二硫鍵蛋白質及糖蛋白等。生物學途徑分析結果顯示，

7、殼聚糖膜和膠原蛋白/殼聚糖膜表面吸附蛋白參與的生物學途徑分別為40個和19個，其中兩者共同的途徑為16個。對粘著斑、細胞外基質-受體反應和肌動蛋白細胞骨架調控及補體與凝血級聯(lián)反應途徑中涉及的蛋白質進行了詳細的討論。綜合分析后，對兩種材料表面吸附的蛋白質與細胞粘附的關系進行了初步的分析。
　　 6.采用Prosite數據庫對蛋白質進行功能motif序列分析。包括RGD和LDV序列，分析結果表明，兩種材料表面吸附蛋白質中共有8種結構