熒光定量PCR快速檢測登革1型病毒.pdf

1、一、研究背景和目的
　　 登革病毒(dengue virus，DEN)屬黃病毒科黃病毒屬，為單股正鏈RNA病毒，體積較小，約45～55nm，依抗原性不同分為四個血清型。登革病毒主要通過埃及伊蚊和白紋伊蚊等媒介昆蟲傳播，引起登革熱以及發(fā)病率和死亡率很高的登革出血熱和登革休克綜合征。登革病毒病流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)，每年約有5000萬至1億人感染，是一種分布廣、發(fā)病多、危害較大的人類傳染病，已成為全球公共衛(wèi)生關注的焦點之一。

2、　　 登革熱的診斷目前主要依賴病毒分離培養(yǎng)以及血清中特異性IgM、IgG抗體測定，血清學診斷由于登革抗體與其他黃病毒存在交叉反應，故存在一定的局限性;病毒的分離鑒定，由于費時費力，技術要求高，不適合臨床使用。分子生物學檢測技術的發(fā)展，為登革熱的早期診斷提供了可能，應用普通RT-PCR方法可在1天內進行登革病毒的鑒定和分型診斷，但該方法易造成標本間的交叉污染而得到假陽性結果。TaqMan實時熒光定量PCR技術，相對于常規(guī)的PCR技術而言

3、，具有更高的敏感性、特異性和重復性。而且還具有快速、高通量、污染少等特點。本研究欲建立更省時、特異，可對登革1型病毒進行早期診斷的實時熒光定量PCR方法。
　　 隨著分子生物學技術的飛速發(fā)展，實時熒光定量PCR技術在生物學研究中的應用越來越廣泛。實時熒光定量PCR技術是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。它在常規(guī)PCR基礎上添加了熒光染料或熒光探

4、針。熒光染料能特異性摻入DNA雙鏈，發(fā)出熒光信號，而不摻入雙鏈中的染料分子不發(fā)出熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物增加完全同步。熒光探針法是將熒光共振能量傳遞技術應用于常規(guī)PCR中，在探針的5’端標記一個熒光報告基團(R)，3'端標記一個淬滅基團(Q)，兩者可構成能量傳遞結構，即5’端熒光基團所發(fā)出的熒光可被淬滅基團吸收或抑制;當兩者距離較遠時，抑制作用消失，報告基團熒光信號增強，熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號。利用以上熒光產生

5、原理，在PCR過程中可以連續(xù)不斷地檢測反應體系中熒光信號的變化。當信號增強到某一域值(PCR反應的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，域值的缺省設置為3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍)時，Ct值被記錄下來。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是:每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環(huán)數。在這一技術的發(fā)展過程中，兩個重要的發(fā)現起著關鍵的作用:
　　 ①在20世紀90年代早期，TaqDN

6、A多聚酶的5’核酸外切酶活性的發(fā)現，它能降解特異性熒光標記探針，因此使得間接地檢測PCR產物成為可能。
　　 ②此后熒光雙標記探針的運用使得在一個密閉的反應管中實時地監(jiān)測反應全過程成為可能。
　　 這兩個發(fā)現的結合以及相應的儀器和試劑的商品化發(fā)展導致實時熒光定量PCR技術在研究工作中的廣泛運用。1996年，美國應用生物系統(tǒng)公司（Applied Biosystems，ABI）的ABIPrism7700和5700、羅氏公司(

7、Roehe)的Light Cycler TM等儀器率先投入商業(yè)使用。它們的擴增和檢測全部自動化、耗時短、工作效率高。國內使用較多的有ABI Prism7000、7900、7700型和LightCylerTM等。ABIPrism7900等RQ-PCR儀可用于高通量（384孔板）檢測，而ABIPriSm7000則利用了多色多通道技術。目前最常用的實時熒光定量PCR產物的檢測技術都是應用熒光染料或基團，并將PCR與實時信號檢測相結合，其中最簡

8、單的是雙鏈DNA嵌合熒光染料技術，該法成本低廉，但SYBRGreen熒光染料能與所有的DNA雙鏈相結合，特異性不如TaqMan探針法。要想用熒光染料法得到比較好的定量結果，對PCR引物設計的特異性和PCR反應的質量要求就比較高。而TaqMan探針法則是高度特異的定量PCR技術，其核心是利用Taq酶的3'-5’外切核酸酶活性，切斷探針，產生熒光信號。由于探針與模板是特異性結合，所以熒光信號的強弱就代表了模板的數量。隨著研究的深入及試劑的商

9、品化，又發(fā)展衍生出更多的熒光定量PCR檢測技術，如TaqMan MGB法、Molecular Beacon法、Amplisensor、Light cycler、complex probes等。
　　 二、研究方法
　　 1、引物探針設計及標準曲線建立:從GenBank中下載八十株不同年份和不同地區(qū)的登革1型病毒基因組全序列，登革2、3、4型病毒以及黃病毒屬其它病毒也各下載十株，尋找型內保守型外特異的序列，使用Beacon

10、 Designer 7.0軟件設計引物探針。將含有保守序列的質粒經過10倍系列稀釋后，進行熒光定量PCR反應得到相應的擴增曲線和標準曲線。
　　 2、熒光定量PCR特異性、重復性、再現性、敏感性實驗:用建立的熒光定量PCR方法對登革1-4型病毒標準株以及乙型腦炎減毒活疫苗株進行檢測。線性化后的質粒10倍倍比稀釋6個濃度，從1.01×107稀釋到1.01×102copies/μl，分不同的時間重復三次，每次做三個重復孔，驗證重復性

11、和再現性。此外，對PMDns2a質粒進行10倍倍比稀釋，熒光定量PCR檢測比較其敏感性，將擴增片段反轉錄為RNA，進行倍比稀釋做敏感性檢測。
　　 3、臨床標本檢測:對廣州市第八人民醫(yī)院提供的cDNA，以及對東莞疑似病人血清提取RNA并反轉錄的cDNA，進行熒光定量PCR檢測，用登革病毒總引物探針進行驗證，并且根據Ct值對熒光定量PCR方法以及常規(guī)PCR方法進行比較。
　　 三、研究結果
　　 1、引物探針設計:

12、經比對，在登革病毒序列的NS2A區(qū)尋找到一段80bp的序列，并設計了引物探針，引物探針與登革1型病毒比對，具有很好的保守性，與其它三型病毒以及黃病毒屬的其它病毒，比如日本腦炎病毒、基孔肯亞病毒、西尼羅河病毒以及發(fā)病相似的麻疹病毒比對，另外也與人的基因組進行比對，都具有很好的特異性。
　　 2、標準曲線建立:得到標準曲線相關系數R2=0.999，擴增效率Eff=96.5％，回歸方程Y=-3.410logX+34.87（Y為Ct值，

13、X為模板濃度），并且對Ct值和模板濃度的對數值進行相關與回歸分析，直線相關系數r=-1.000，P=0.000，回歸系數為-3.410，P=0.000，從中可以看出，所作的標準曲線的Ct值與初始濃度有較好的線性關系。
　　 3、特異性:對登革1,2，3，4型病毒提取核酸，采用本方法對登革1型病毒的擴增結果為陽性，而對其它三型登革病毒以及乙型腦炎病毒提取核酸的擴增結果均顯示為陰性，表明所建立的針對登革1型病毒的熒光定量PCR方法不

14、會受到其它三型登革病毒以及乙型腦炎病毒干擾。
　　 4、重復性和再現性:重復性標準差( SDr)在0.04與0.44之間，再現性標準差(SDR)在0.14與0.29之間，變異系數＜2％，并且通過析因方差分析得濃度和時間之間不存在交互效應( F=0.691，P=0.726)，不同稀釋濃度之間的Ct值有差異(F=10528.497，P=0.000);三個重復時間之間并無差異(F=0.451，P=0.641)。說明建立的方法具有良好的

15、重復性和再現性。
　　 5、敏感性:用本研究建立的熒光定量PCR方法檢測質粒，敏感性可達到1copy/μl。用RNA進行敏感性檢測，可達102copies/μl。并且對Ct值和RNA濃度的對數值進行相關與回歸分析，直線相關系數r=-1.000，P=0.000，回歸系數為-3.305，P=0.000，認為Ct值與RNA濃度的對數值直接存在直線回歸關系，得回歸方程Y=-3.305logX+39.727（Y為Ct值，X為RNA濃度）。

16、
　　 6、臨床標本檢測:對廣州市第八人民醫(yī)院提供的cDNA樣本以及東莞疑似病人血清進行檢測。采用本研究所建立的登革1型病毒型特異引物探針進行熒光定量PCR檢測，對本方法以及常規(guī)PCR方法進行配對計數資料的卡方檢驗(x2檢驗)，P＝0.000，表明兩種檢測方法有統(tǒng)計學差異，而本研究方法陽性率明顯高于常規(guī)PCR方法，表明本研究方法優(yōu)于常規(guī)PCR。
　　 四、結論
　　 本研究成功設計了針對登革1型病毒的型特異性引物