凋亡與增殖相關基因在損傷兔關節(jié)軟骨細胞中的表達變化.pdf

1、目的：建立兔關節(jié)軟骨細胞損傷模型并分析細胞損傷后不同時間點的半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）與細胞增殖核抗原（PCNA）基因表達變化。
　　方法：⑴取4周齡健康新西蘭兔膝關節(jié)軟骨，以機械分離和酶消化分離相結合的方法獲取膝關節(jié)軟骨細胞，利用Ⅱ型膠原免疫熒光染色鑒定軟骨細胞。⑵建立細胞劃傷模型。⑶實時熒光定量PCR技術檢測正常組和劃傷組caspase-3，PCNA和二型膠原蛋白（collagenⅡ）基因mRNA表達

2、變化。⑷蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測正常組和劃傷組caspase-3，PCNA蛋白表達變化。
　　結果：①通過免疫熒光技術證實：分離培養(yǎng)兔關節(jié)軟骨細胞成功。②參照近幾年細胞損傷文獻，建立軟骨細胞體外劃傷模型，關節(jié)軟骨細胞劃傷后，外力直接作用區(qū)域軟骨細胞胞體完全消失，呈空白區(qū)域，鄰近部位軟骨細胞未見改變。損傷1 d時，劃痕周邊細胞皺縮，胞質折光性增強，顆粒物質聚集。損傷3d時，劃痕周邊細胞核大，胞質清晰，自胞體向空

3、白區(qū)域伸出較多突起，漸有劃痕兩側細胞相互聯(lián)系。損傷后7 d，空白區(qū)域已被大部分增殖細胞覆蓋。③實時熒光定量PCR技術檢測顯示：在損傷后1 d組的軟骨細胞的caspase-3 mRNA表達比正常組升高，損傷后3 d組與7 d組caspase-3 mRNA表達均較正常組及損傷后1 d組相比明顯下降，且差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中損傷后7 d組caspase-3 mRNA表達最低；與正常組相比，損傷后1 d組PCNA mRNA表達下

4、降，損傷后3 d組與1 d組相比未見變化，7 d組與1d組相比表達上升；與正常組相比，損傷后1天組collagenⅡmRNA表達明顯低于正常細胞水平（P<0.05），損傷后3d組與7 d組較1 d組上升，其中第7天時，幾乎達到正常水平。④蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測顯示：蛋白表達水平與基因表達水平相似。在損傷后1 d組的軟骨細胞的caspase-3蛋白表達比正常組升高，在3d組達到最高峰，5d組出現(xiàn)降低，7d組恢復至正

5、常組水平，正常組與7d組均較3 d組有統(tǒng)計學差異（P<0.05）；PCNA蛋白表達在損傷后1d組與3d組出現(xiàn)降低，5d組與7d組出現(xiàn)上升且3d組與5d組相比較有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。
　　結論：在體外關節(jié)軟骨細胞損傷模型中發(fā)現(xiàn)：在關節(jié)軟骨細胞受到機械性損傷刺激下，軟骨細胞在損傷早期出現(xiàn)細胞凋亡增強，隨后細胞自身調節(jié)，增殖能力增強，凋亡現(xiàn)象減弱。說明關節(jié)軟骨細胞在體外培養(yǎng)存在自身抗凋亡能力。這為我們進一步了解軟骨細胞損傷后生物