皮瓣缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡和相關(guān)凋亡基因BAX變化規(guī)律的研究.pdf

1、目的：應(yīng)用免疫組化方法；RNA反轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增相結(jié)合技術(shù)(RT-PCR)的方法，研究皮瓣組織缺血再灌注時(shí)相關(guān)凋亡基因Bax表達(dá)的變化規(guī)律；應(yīng)用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的d-UTP缺口末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)的方法檢測(cè)皮瓣組織細(xì)胞的凋亡情況及其變化規(guī)律，探討兩者之間的相關(guān)性。進(jìn)而揭示相關(guān)凋亡基因Bax在皮瓣損傷時(shí)與細(xì)胞凋亡的關(guān)系和變化規(guī)律，從而為皮瓣組織缺血再灌注損傷(IR)探索一條新的保護(hù)途徑。

2、 方法： 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性健康Wister大鼠50只，稱重，編號(hào)。 2.皮瓣制作方法：3％戊巴比妥鈉(0.1～0.13ml/100mg)腹腔注射麻醉，每小時(shí)追加麻醉一次，每次0.05ml以維持麻醉。大鼠仰臥，四肢固定，剪除腹毛，75％酒精消毒，按照Petry JJ等描述的方法，于右下腹設(shè)計(jì)一以腹壁淺血管為蒂的軸形皮瓣，大小約3cm×6cm。 3.試驗(yàn)動(dòng)物分組：將大鼠隨機(jī)分為兩組:(1)對(duì)照組25只：皮瓣形成后

3、原位縫合，不做其它處理。時(shí)間點(diǎn)的選取以形成皮瓣后9、10、15、21、33小時(shí)分為5組與實(shí)驗(yàn)組形成對(duì)照，每組五只大鼠。(2)缺血再灌注組，即IR組25只：皮瓣形成后，用5-0絲線結(jié)扎腹壁淺動(dòng)脈發(fā)出點(diǎn)遠(yuǎn)端的股動(dòng)脈，用微血管夾夾閉腹壁淺動(dòng)脈發(fā)出點(diǎn)近端的股動(dòng)脈，皮瓣原位縫合。8小時(shí)后再次手術(shù)去除動(dòng)脈夾恢復(fù)血供。按去除動(dòng)脈夾血管再灌注后0、1、6、12、24小時(shí)分為5個(gè)組，每組五只大鼠。 4、取材：對(duì)照組和試驗(yàn)組均分別按照時(shí)間點(diǎn)于皮瓣中

4、段邊緣取全層皮瓣組織1cm×0.5cm。所取組織中部分用多聚甲醛及時(shí)固定待做石蠟切片及免疫組化染色，以備細(xì)胞凋亡和Bax的檢測(cè)。部分液氮冰凍后，置-80度冰箱中保存，以備RT-PCR檢測(cè)。 5、觀測(cè)指標(biāo) (1)依照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟和方法，以平均陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比作為凋亡細(xì)胞陽(yáng)性指數(shù)(AI)。 (2)Bax基因的蛋白表達(dá)檢測(cè)：切片脫蠟入水后阻斷內(nèi)源性POD，修復(fù)抗原，以S-P免疫組化法檢測(cè)蛋白表達(dá)，DAB顯色，胞

5、膜或胞漿中有棕褐色顆粒者為Bax蛋白陽(yáng)性，結(jié)果以Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)指數(shù)(HIS)表示。切片分別于光鏡400倍和100倍下放大，采用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)：經(jīng)圖像分析儀隨機(jī)選擇5個(gè)視野，檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(以A表示)分級(jí)0~1％=0、1~10％=1、10~50％=2、50~80％=3、80~100％=4；檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞顯色強(qiáng)度(以B表示)分級(jí)0(陰性)、1(弱陽(yáng)性)、2(陽(yáng)性)、3(強(qiáng)陽(yáng)性)HIS=A×B。 (3)Bax mRNA表達(dá)檢測(cè)，

6、提取總RNA后采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)，PCR產(chǎn)物電泳和半定量分析，取RT-PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，用UVP凝膠圖像成像系統(tǒng)拍攝打印實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。Bax的mRNA的相對(duì)含量用β-actin條帶灰度值標(biāo)化后的Bax條帶灰度值表示。 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有的試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示，采用SPSS11.5軟件進(jìn)行檢驗(yàn)，顯著性分析以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.TU

7、NEL細(xì)胞的觀測(cè)結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)觀測(cè)到，在光鏡下觀察免疫組化切片時(shí)發(fā)現(xiàn)，在正常大鼠皮瓣組織中，即掀起皮瓣即刻的標(biāo)本中，TUNEL細(xì)胞偶零星可見(jiàn)，凋亡細(xì)胞主要位于皮膚表皮層。隨著缺血和再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，TUNEL細(xì)胞數(shù)量急劇增多，實(shí)驗(yàn)組再灌注后隨著時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡速率逐漸降低，但其蛋白表達(dá)呈現(xiàn)增高的趨勢(shì)。對(duì)照組蛋白表達(dá)亦呈增高趨勢(shì)，但較實(shí)驗(yàn)組蛋白表達(dá)低。本實(shí)驗(yàn)未觀測(cè)到恢復(fù)至正常的時(shí)間段。并且各時(shí)間段對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此推斷

8、，細(xì)胞凋亡是皮瓣組織缺血再灌注損傷因素的重要因素之一。 2.Bax蛋白的表達(dá)：本實(shí)驗(yàn)觀測(cè)到，實(shí)驗(yàn)組隨著缺血和再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，Bax蛋白表達(dá)急劇增多，至再灌注后6小時(shí)達(dá)到高峰。此后開(kāi)始緩慢下降，本實(shí)驗(yàn)尚未觀測(cè)到恢復(fù)正常時(shí)間的時(shí)間段。對(duì)照組Bax蛋白表達(dá)在各時(shí)間段呈下降趨勢(shì)，本實(shí)驗(yàn)未觀測(cè)到恢復(fù)至正常時(shí)的時(shí)間段。兩組中各時(shí)間段經(jīng)SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且觀測(cè)到Bax變化趨勢(shì)和TUNEL細(xì)胞的變化呈現(xiàn)相關(guān)性。由此可以推斷：

9、細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax在皮瓣組織中起著相關(guān)調(diào)控作用。 3.Bax mRNA的表達(dá)：本實(shí)驗(yàn)觀測(cè)到，皮瓣組織中Bax基因的mRNA經(jīng)過(guò)RT-PCR擴(kuò)增后，得到特異性的DNA片段，長(zhǎng)度為407bp。在皮瓣缺血再灌注損傷后，Bax的變化隨著缺血再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，該基因轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平逐漸增高，至再灌注后6小時(shí)達(dá)到高峰，后逐漸降低，恢復(fù)至正常時(shí)間本實(shí)驗(yàn)尚未得出。對(duì)照組Bax基因mRNA呈下降趨勢(shì)，本實(shí)驗(yàn)未觀測(cè)到其恢復(fù)至正常時(shí)的時(shí)間段。其變化

10、基本與Bax蛋白在皮膚組織中的表達(dá)水平基本一致。由此可以進(jìn)一步推斷出：細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax在皮瓣組織細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著相關(guān)調(diào)控作用。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察皮瓣組織在發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí)的細(xì)胞凋亡情況和凋亡相關(guān)基因Bax的變化規(guī)律，得出以下幾點(diǎn)結(jié)論： 1、皮瓣組織缺血再灌注時(shí)，細(xì)胞凋亡是其損傷的重要因素之一。并且隨著時(shí)間的推移血流的恢復(fù)和損害因素的減少，細(xì)胞凋亡速率逐漸降低。 2、通過(guò)免疫組化法和RT-PCR的實(shí)