RNA干擾技術阻斷黏著斑激酶表達對肝星狀細胞膠原代謝的影響.pdf

1、肝硬化是威脅人類健康的常見病和多發(fā)病，而肝纖維化是肝硬化形成的共有病理改變和必經途徑。因此，如何阻止或逆轉肝纖維化是治療各種慢性肝病、預防肝硬化的關鍵。
　　 肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSC）是肝臟合成膠原的最主要細胞；HSC活化、增殖、遷移進而合成大量的膠原等細胞外間質（extracellular matrix，ECM）成分是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)。
　　 黏著斑激酶（focal ad

2、hesion kinase，F(xiàn)AK）在整合素介導的信號轉導中發(fā)揮關鍵作用。研究顯示，F(xiàn)AK磷酸化后與多種器官組織纖維化疾病有關，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中亦發(fā)揮重要作用。我們的前期研究表明，膽總管結扎大鼠纖維化肝組織中FAK表達增強，F(xiàn)AK磷酸化后可以促進HSC的膠原合成，且在體外運用質粒轉染方法使外源性黏著斑激酶相關非激酶（FAK related non-kinase，F(xiàn)RNK）在HSC過表達，可以抑制HSC的膠原合成。因此，我們推測

3、抑制體內FAK的活化和表達可能成為逆轉肝纖維化的新靶點和新方向。
　　 RNA干擾（RNA interference，RNAi）能高效特異地抑制靶基因的轉錄，進而下調相應蛋白水平及功能，是目前研究基因功能和信號轉導通路的最有力工具。
　　 為此，我們采用RNAi技術，在陽離子聚合物介導下將干擾質粒瞬時轉染HSC，進一步研究特異性阻斷FAK表達對纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）刺激的HSC膠原代謝的影響及其機制

4、，為肝纖維化的治療提供理論依據(jù)。
　　 目的：應用FAK shRNA質粒轉染HSC，探討特異性阻斷FAK表達對FN刺激的HSCⅠ、Ⅲ型膠原表達的影響，以及該過程中MMP-13、TIMP-1、MMP-2、TIMP-2和MT1-MMP的表達變化。
　　 方法：應用體外細胞培養(yǎng)技術，在陽離子聚合物介導下瞬時轉染FAK shRNA質粒，實驗分為五組：①空白對照組（簡寫為Con）；②FN刺激組（簡寫為FN）；③轉染試劑組（簡寫為S

5、ofast）；④陰性對照組pEGFP-HK（簡寫為HK組）；⑤pEGFP-FAK shRNA干擾組（簡稱為FAK shRNA組）。②～⑤組中FN濃度均為10μg·mL-1。采用熒光顯微鏡及流式細胞術檢測轉染效率，采用Western blot和real-time Q-PCR技術檢測FAK shRNA質粒轉染前后FAK與Ⅰ型膠原的蛋白和mRNA表達；real-time Q-PCR技術檢測FAK shRNA質粒轉染前后Ⅲ型膠原mRNA表達情況

6、；Western blot和real-time Q-PCR技術檢測MMP-13、TIMP-1、MMP-2、TIMP-2和MT1-MMP表達。
　　 結果：①轉染后48 h，利用熒光顯微鏡及流式細胞術證實轉染成功，轉染效率約40％； Western blot分析，F(xiàn)AK shRNA轉染后48 h，可顯著下調FAK蛋白的表達，蛋白下調率為72.53％； real-timeQ-PCR結果顯示FAK shRNA下調FAK mRNA的表達

7、，F(xiàn)AK shRNA轉染HSC24 h后下調率為76.73％；②FAK shRNA抑制Ⅰ型膠原mRNA和蛋白的表達：real-time Q-PCR結果顯示，與HK組相比，F(xiàn)AK shRNA組Ⅰ型膠原mRNA表達明顯減少，最高下調點出現(xiàn)于FAKshRNA質粒轉染HSC后36 h（0.69±0.03 vs1.96±0.15），下調率為64.80％； Western blot結果顯示FN組Ⅰ型膠原蛋白的合成顯著高于Con組，F(xiàn)AK shRNA

8、組Ⅰ型膠原蛋白表達同HK組相比顯著下降，最高下調點出現(xiàn)于FAK shRNA質粒轉染HSC后48 h（0.85±0.03vs2.58±0.21），下調率為67.05％；③FAK shRNA抑制Ⅲ型膠原mRNA的表達：real-time Q-PCR結果顯示在轉錄水平上，F(xiàn)N組Ⅲ型膠原的合成顯著高于Con組，F(xiàn)AK shRNA組Ⅲ型膠原的合成同HK組相比顯著下降，最高下調點出現(xiàn)于FAK shRNA質粒轉染HSC后36h（0.59±0.07 v

9、s1.62±0.12），下調率為63.58％；④FAK shRNA上調MMP-13 mRNA和蛋白的表達：real-time Q-PCR和Western blot結果顯示在轉錄和翻譯水平上，F(xiàn)N組MMP-13的表達顯著低于Con組，而FAK shRNA組MMP-13 mRNA和蛋白的表達較HK組顯著增加，最高上調點分別出現(xiàn)于FAK shRNA質粒轉染HSC后36 h和48 h（1.24±0.04 vs0.79±0.03，1.74±0.2

10、0 vs1.09±0.09），上調率分別為56.96％和59.63％；⑤FAK shRNA抑制TIMP-1mRNA和蛋白的表達：real-time Q-PCR和Western blot結果顯示在轉錄和翻譯水平上，F(xiàn)N組TIMP-1的表達顯著高于Con組，而FAK shRNA組TIMP-1的表達較HK組顯著下降，最高下調點分別出現(xiàn)于FAK shRNA質粒轉染HSC后36 h和48 h（0.49±0.02 vs1.72±0.10，0.76±

11、0.08 vs2.31±0.24），下調率分別為71.51％和67.10％；⑥FAK shRNA下調TIMP-1/MMP-13比值：無論是在轉錄水平還是在翻譯水平上，F(xiàn)N組TIMP-1/MMP-13比值均較Con組升高，P<0.05，但與Sofast組、HK組比較無明顯差異，P>0.05，F(xiàn)AK shRNA組TIMP-1/MMP-13比值明顯低于HK組，最高下調點分別出現(xiàn)于FAK shRNA質粒轉染HSC后36h和48 h（0.42±0

12、.03vs2.19±0.17，0.44±0.01 vs2.11±0.05），下調率分別為80.82％和79.15％；⑦FAK shRNA上調MT1-MMP mRNA和蛋白的表達：在轉錄和翻譯水平上，F(xiàn)N組MT1-MMP的表達均顯著低于Con組，而FAK shRNA組MT1-MMP mRNA和蛋白的表達較HK組顯著增加，最高上調點分別出現(xiàn)于FAK shRNA質粒轉染后36 h和48 h（1.41±0.08 vs0.85±0.04，1.72

13、±0.10 vs1.06±0.12），上調率分別為65.88％和62.26％；⑧FAK shRNA上調MMP-2 mRNA和蛋白的表達：在轉錄和翻譯水平上，F(xiàn)N組MMP-2的表達顯著低于Con組，而FAK shRNA組MMP-2 mRNA和蛋白的表達較HK組顯著增加，最高上調點分別出現(xiàn)于FAK shRNA質粒轉染HSC后36h和48 h（1.36±0.06 vs0.82±0.02，1.33±0.05 vs0.80±0.05），上調率分別

14、為65.85％和66.25％；⑨FAKshRNA抑制TIMP-2 mRNA和蛋白的表達：在轉錄和翻譯水平上；FN組TIMP-2的表達顯著高于Con組，F(xiàn)AK shRNA組TIMP-2 mRNA和蛋白的表達較HK組顯著下降，最高下調點分別出現(xiàn)于FAK shRNA質粒轉染HSC后36 h和48 h（0.73±0.03 vs1.54±0.04，0.53±0.08 vs1.31±0.02），下調率分別為52.60％和59.54％；⑩FAK sh

15、RNA下調TIMP-2/MMP-2比值：無論是在轉錄水平還是在翻譯水平上，F(xiàn)N組TIMP-2/MMP-2比值較Con組升高，F(xiàn)AK shRNA組TIMP-2/MMP-2比值顯著低于HK組，最高下調點分別出現(xiàn)于FAK shRNA質粒轉染HSC后36h和48 h（0.54±0.05 vs1.88±0.08，0.40±0.05 vs1.64±0.13），下調率分別為71.28％和75.61％。
　　 結論：在陽離子聚合物介導下瞬時轉染