GPC3在肝細胞癌轉移及侵襲中的作用及機制研究.pdf

1、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，以亞洲和非洲高發(fā)。近些年西方發(fā)達國家的HCC發(fā)病率也呈上升趨勢，尤其是美國和加拿大。我國是世界上HCC高發(fā)地區(qū)之一，每年發(fā)病人數(shù)約為30萬人，位于常見腫瘤的第3位。此外，我國肝癌的年死亡率為20.40/10萬，其中城市為19.98/10萬，農(nóng)村為23.59/10萬，分別居惡性腫瘤死亡率的第二位和第一位。手術切除仍然是治愈早期肝癌的最佳選擇，

2、然而，即使是根治性切除之后，60％-70％的患者在術后5年內(nèi)會發(fā)生轉移和復發(fā)。盡管一些臨床因素（如腫瘤分化程度、腫瘤大小、是否脈管侵潤等）與患者預后密切相關，但是HCC的發(fā)生發(fā)展的分子機制目前仍不明確，因此，探索肝癌的發(fā)病基礎及轉移復發(fā)的相關因素，尋找肝癌早期診斷、預測轉移復發(fā)的生物指標和靶向治療的靶點，是目前腫瘤學研究的迫切任務之一。
　　 硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPGs)是一類攜帶一條或多條硫酸乙酰肝素鏈的蛋白。這些肝素鏈

3、是由長線狀的葡糖醛酸聚合物/N-乙酰氨基葡糖重復雙糖單位組成。鏈的長度高度均可變，大部分雙糖單位都受N-去乙?；?、去硫酸化、差向異構化和O-去硫酸化的調(diào)節(jié)。去乙?；T導了硫酸乙酰肝素鏈產(chǎn)生高強度的負電荷，從而允許硫酸乙酰肝素糖蛋白以較為雜亂的方式與帶有正電荷區(qū)域的蛋白產(chǎn)生相互作用，其中包括了一些所謂的“肝素結合生長因子”，如成纖維細胞生長因子(FGFs)，Wnt，Hedgehogs(Hhs)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)。磷脂酰肌醇蛋白聚

4、糖(GPC)是硫酸乙酰肝素糖蛋白家族中的一員，它的成員通過磷脂酰肌醇錨(GPI)連接于細胞表面。哺乳動物的基因組包括了GPC家族的六個成員:（GPC1至GPC6），還有其他兩個成員在果蠅中發(fā)現(xiàn)（dally和dlp）。
　　 GPC3基因定位于人染色體Xq26.1區(qū)，編碼的GPC3蛋白的相對分子質(zhì)量約為70Kda，由580個氨基酸組成。GPC3的核心蛋白由兩個部分組成，分別40kDa的GPC3氨基端(N-)片段及30kDa的GPC

5、3羧基端(C-)片段。1996年，Pilia等首先報道了GPC3基因突變和功能缺失的患者出現(xiàn)了過度生長綜合征(SGBS)，這是一種X連鎖異常的疾病，主要表現(xiàn)為產(chǎn)前、產(chǎn)后胎兒的過度生長，并伴有廣泛的內(nèi)臟和骨骼的異常，同時還會增加胚胎源性腫瘤發(fā)生的可能性。隨后的研究又表明，GPC3的突變會導致細胞凋亡和細胞增殖的比例失調(diào)，而這可能是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。GPC3還可與肝素結合型蛋白相結合，如基質(zhì)成分、細胞粘附分子、酶和酶抑制物、生長因

6、子等，參與調(diào)節(jié)細胞分化、增殖、粘附和遷移等生理過程等，除此之外，其還可能參與調(diào)節(jié)一部分中胚層組織和器官發(fā)育的過程。隨后有大量的研究報道表明GPC3在肝細胞癌、惡性黑色素瘤、Wilm's瘤、大腸癌、肝胚細胞瘤和成神經(jīng)細胞瘤高表達，而在間皮瘤、乳腺癌、肺腺癌以及卵巢癌中表達顯著下調(diào)，提示GPC3在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。
　　 本課題組前期已完成以下的研究工作:應用免疫組化及組織芯片技術，通過檢測36例原發(fā)性肝細胞癌組織和3

7、3例原發(fā)性肝癌癌旁組織以及一些其他常見腫瘤組織和其癌旁組織中GPC3蛋白的表達情況。結果表明:(1)36例原發(fā)性肝細胞癌組織及33例原發(fā)性肝細胞癌癌旁組織中GPC3蛋白的表達率分別為66.17％(24/36)，3.0％(1/33)，兩者之間差異有顯著性;(2) GPC3蛋白在原發(fā)性肝細胞癌、肺鱗癌、癌旁慢性淺表性胃炎組織中表達，而乳腺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、宮頸癌、膽管細胞癌組織中無表達;(3)原發(fā)性肝細胞癌組織中GPC3蛋白表達與患

8、者性別、年齡、病理分級無顯著相關性。隨后我們收集和分析了61例原發(fā)性肝細胞癌患(HCC)者術后標本切片，比較GPC3高表達患者與GPC3低表達患者之間的生存時間差異。結果表明，GPC3的表達與接受手術患者的轉移/復發(fā)高度相關，GPC3高表達的術后患者發(fā)生轉移或者復發(fā)的風險是低表達患者的3.214倍。生存分析顯示GPC3高表達的肝癌患者預后顯著差于低表達者。此外，多變量分析提示GPC3在HCC中是一個獨立的預后預測參數(shù)。同時，我們還采用了

9、酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme Linked ImmunosorbentAssay)法分別檢查HCC30例，其他肝臟源性腫瘤8例，其他肝臟疾?。ㄈ绺窝?、肝硬化、肝良性腫瘤）13例，以及25例正常人血清標本中GPC3及甲胎蛋白的表達。結果顯示，血清GPC3蛋白水平診斷原發(fā)性肝細胞癌的敏感性和特異性分別為50％和92％，聯(lián)合甲胎蛋白檢測可以使診斷敏感性從50％提升至73.3％。GPC3蛋白水平的增高提示原發(fā)性肝細胞癌患者腫瘤分化低、臨床TN

10、M分期晚、肝硬化程度明顯。以上臨床數(shù)據(jù)提示GPC3在肝癌發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，故我們采用micro RNA對肝癌發(fā)生的分子機理進行研究。在研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-219-5p在83例HCC腫瘤組織中及3株肝癌細胞株中顯著下調(diào)，其與HCC患者的預后、病理分級、腫瘤大小密切相關;在細胞學上，miR-219-5p能抑制細胞增殖。進一步研究表明，miR-219-5p負性調(diào)節(jié)GPC3表達，在肝癌中發(fā)揮抑癌作用。綜上所述，GPC3蛋白是具有前景的

11、特異性HCC腫瘤標志物，可用于HCC的診斷及判斷預后，并可能與腫瘤轉移相關。
　　 在前期研究的工作基礎上，擬應用RNA干擾和基因轉染技術進一步探討GPC3在肝癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲過程中的作用。針對來源于同一遺傳背景，但具有不同轉移潛能的肝癌細胞株MHCC-97H和MHCC-97L，應用載體轉染方法使GPC3在細胞中表達下調(diào)或上調(diào)，來觀察GPC3在體外肝癌細胞增殖、侵襲、轉移中的作用;同時，擬將轉染后細胞注射至裸鼠皮下，觀察腫瘤生

12、長速度，從而明確GPC3在體內(nèi)肝癌形成過程中的作用。本文旨在探討GPC3作為肝癌的腫瘤標志物及治療靶點的可能性，為肝癌患者的早期診斷、預測預后及治療手段提供理論基礎。
　　 方法：
　　 1.檢測肝癌細胞株MHCC-97H和MHCC-97L的GPC3表達水平通過western blot和熒光定量PCR檢測兩株細胞的GPC3蛋白/基因表達量，以一株正常肝細胞作為對照，從而驗證高低轉移能力的細胞株的GPC3表達情況，為下一步

13、實驗提供依據(jù)。
　　 2.上調(diào)MHCC-97L的GPC3表達量以觀察其對肝癌細胞生物學行為的影響上一步實驗已證明MHCC-97L的GPC3表達量較低，故采用基因重組技術及限制性內(nèi)切酶技術構建表達載體p-EGFP-C3-GPC3，經(jīng)鑒定后通過脂質(zhì)體lipo2000轉染至MHCC-97L中，通過流式細胞儀篩選帶熒光的細胞，經(jīng)G418培養(yǎng)后建立穩(wěn)定轉染GPC3的細胞株，最后通過western blot和熒光定量PCR檢測GPC3在細胞

14、表達情況。以空載體p-EGFP-C3及未轉染細胞作為對照，通過MTT、細胞克隆、transwell等實驗，觀察三組細胞的生物學行為差異。最后，通過裸鼠成瘤實驗觀察三組細胞體內(nèi)的腫瘤增殖能力。
　　 3.下調(diào)MHCC-97H的GPC3表達量以觀察其對肝癌細胞生物學行為的影響首先設計了4對靶向GPC3的shRNA，合成后插入pGenesil-1 shRNA表達載體，通過脂質(zhì)體分別轉染MHCC-97H細胞，經(jīng)G418篩選后建立穩(wěn)定轉染

15、細胞株，使用western blot及熒光定量PCR檢測各組GPC3表達情況，篩選表達量最低一組用作后續(xù)實驗。以空載體及未轉染細胞作為對照，通過MTT、細胞克隆、transwell等實驗，觀察三組細胞的生物學行為差異。最后，通過裸鼠成瘤實驗觀察三組細胞體內(nèi)的腫瘤增殖能力。
　　 4.GPC3影響肝癌細胞生物學行為的機制探討我們選取Akt通路作為研究對象，通過WB來檢測通路上的相關分子（包括Akt和磷酸化Akt）在各組細胞中的表達

16、。
　　 5.統(tǒng)計學處理應用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料以均數(shù)士標準差（x±s）表示。MTT細胞增殖檢測、腫瘤體積觀察均采用析因設計方差分析比較各組間差異;對比轉染前后和干擾前后肝癌細胞株的GPC3蛋白和RNA水平、平板克隆形成實驗、流式細胞術細胞周期實驗、Transwell侵襲實驗、Akt和p38蛋白和RNA表達水平采用單因素方差分析;多重比較采用LSD法，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：

17、r>　　 1.GPC3在肝癌細胞株MHCC-97H和MHCC-97L中的表達結果表明，以正常肝細胞作為對照，肝癌細胞MHCC-97H的GPC3的蛋白及核酸表達水平較高，差異具有顯著性(P=0.000);而與MHCC97H相比較，MHCC-97L的GPC3表達水平較低，差異具有顯著性(P=0.000)。
　　 2.穩(wěn)定表達GPC3對肝癌細胞株生物學行為的影響持續(xù)使用G418進行篩選后，轉染p-EGFP-C3-GPC3和p-EGF

18、P-C3細胞形成明顯克隆，然后進行擴增，最終成功構建穩(wěn)定表達GPC3的MHCC-97L細胞和空白載體細胞，分別命名為MHCC-97L/GPC3和MHCC-97L/con。通過westernblot和qPCR進行檢驗，結果表明，MHCC-97L/GPC3的GPC3表達水平較MHCC-97L/con和未轉染的MHCC-97L顯著升高(P=0.000)，而MHCC-97L/con和未轉染MHCC-97L細胞間的GPC3表達水平無差異(P＞0.

19、05)。
　　 通過MTT法和平板克隆實驗檢測各組細胞體外增殖情況。MHCC-97L/GPC3、MHCC-97L/con和未轉染的MHCC-97L在不同時間點的增殖速度有顯著差異(P＜0.05)。MHCC-97L/GPC3隨著時間的推移，增殖速度明顯加快，與對照組比較有顯著統(tǒng)計學差異(P=0.000)，而MHCC-97L/con和未轉染的MHCC-97L的增殖速度則無顯著差異(P＞0.05)。此外，平板克隆形成實驗結果表明，與M

20、HCC-97L/con和未轉染的MHCC-97L相比，MHCC-97L/GPC3的細胞活力顯著提高(P=0.000)。
　　 細胞體外遷移和侵襲小室檢測穩(wěn)定表達特異性GPC3基因后細胞遷移侵襲能力。遷移實驗結果表明，MHCC-97L/GPC3細胞體外運動能力明顯高于MHCC-97L/con和未轉染的MHCC-97L細胞(P=0.000);此外，侵襲實驗結果也表明，與MHCC-97L/con和未轉染的MHCC-97L細胞相比，MH

21、CC-97L/GPC3細胞的侵襲能力亦是明顯增高(P=0.000)。
　　 裸鼠成瘤實驗檢測穩(wěn)定表達GPC3基因后細胞體內(nèi)成瘤能力。將裸鼠隨機分成3組，分別皮下注射MHCC-97L/GPC3，MHCC-97L和MHCC-97L/con細胞，然后觀察21天，結果發(fā)現(xiàn)MHCC-97L/GPC3注射組裸鼠皮下腫瘤體積明顯大于對照組(P=0.000)。21天后處死裸鼠，將腫瘤稱重，MHCC-97L/GPC3，MHCC-97L和MHCC-

22、97L/con三組的腫瘤平均重量分別為2.987±0.168g，1.801±0.015g和1.758±0.040g， MHCC-97L/GPC3組的瘤重顯著大于MHCC-97L和MHCC-97L/con組，有顯著統(tǒng)計學差異(P=0.000)，而MHCC-97L和MHCC-97L/con組之間的瘤重則無顯著差異(P＞0.05)。
　　 3.GPC3基因表達沉默對肝癌細胞株生物學行為的影響MHCC97-H細胞分別轉染pGenesil

23、-1-GPC3-shRNA1，2，3，4和pGenesil-1-negative，隨后持續(xù)使用G418進行篩選，最終成功構建穩(wěn)定表達GPC3的MHCC-97L細胞和空白載體細胞，分別命名為MHCC97-H/GPC3-shRNA1，2，3，4和MHCC97-H/con-shRNA。通過western blot和qPCR進行檢驗，結果表明，MHCC97-H/GPC3-shRNA1的GPC3表達水平較MHCC97-H/con-shRNA和未轉

24、染的MHCC-97H顯著下降(P=0.000)，而MHCC97-H/con-shRNA和未轉染MHCC-97H細胞間的GPC3表達水平無差異(P＞0.05)。因此選擇MHCC97-H/GPC3-shRNA1作進一步的研究對象。
　　 通過MTT法和平板克隆實驗檢測各組細胞體外增殖情況。MHCC97-H/GPC3-shRNA1、MHCC97-H/con-shRNA和未轉染的MHCC-97H在不同時間點的增殖速度有顯著差異(P=0.

25、000)。MHCC97-H/GPC3-shRNA1的增殖速度較慢，與對照組比較有顯著統(tǒng)計學差異(P=0.000)，而MHCC97-H/con-shRNA和未轉染的MHCC-97H的增殖速度則無顯著差異(P＞0.05)。此外，平板克隆形成實驗結果表明，與MHCC97-H/con-shRNA和未轉染的MHCC-97H相比，MHCC97-H/GPC3-shRNA1的細胞活力顯著減弱(P=0.000)。
　　 細胞體外遷移和侵襲小室檢測

26、GPC3基因沉默后肝癌細胞遷移侵襲能力。遷移實驗結果表明，MHCC97-H/GPC3-shRNA1細胞體外運動能力明顯低于MHCC97-H/con-shRNA和未轉染的MHCC-97H細胞(運動實驗遷移細胞數(shù)目分別為4.647±1.319、14.774±1.112和15.770±2.025，P=0.000);此外，侵襲實驗結果也表明，與MHCC97-H/con-shRNA和未轉染的MHCC-97H細胞相比，MHCC-97L/GPC3細胞

27、的侵襲能力亦是明顯降低(透膜細胞數(shù)分別為4.421±1.536,15.902±1.450，和14.374±2.015, P=0.000)。
　　 裸鼠成瘤實驗檢測GPC3基因敲除后細胞體內(nèi)成瘤能力。將裸鼠隨機分成3組，分別皮下注射 MHCC97-H/GPC3-shRNA1， MHCC-97H和MHCC97-H/con-shRNA細胞，然后觀察21天，結果發(fā)現(xiàn)MHCC97-H/GPC3-shRNA1注射組裸鼠皮下腫瘤體積明顯小于對

28、照組(P=0.000)。21天后處死裸鼠，將腫瘤稱重，MHCC97-H/GPC3-shRNA1，MHCC-97H和MHCC97-H/con-shRNA三組的腫瘤平均重量分別為1.541±0.096g，2.424±0.095g和2.402±0.080g，MHCC97-H/GPC3-shRNA1組的瘤重顯著小于MHCC-97H和MHCC97-H/con-shRNA組，有顯著統(tǒng)計學差異(p=0.000)，而MHCC-97H和MHCC97-H/

29、con-shRNA組之間的瘤重則無顯著差異(P＞0.05)。
　　 4.GPC3過表達（或沉默）能促進（或抑制）Akt通路的活化結果表明，當GPC3表達沉默時，MHCC97-H/GPC3-shRNA1細胞的磷酸化Akt較對照組顯著下降(P=0.000);而當GPC3表達上調(diào)時，MHCC-97L/GPC3細胞的磷酸化Akt水平則較對照組顯著升高(P=0.000)。
　　 結論：
　　 1.利用質(zhì)粒介導的基因轉染技術

30、成功構建了GPC3高表達的肝癌細胞株，初步探討了GPC3的表達對肝癌細胞在體內(nèi)和體外的生物學行為的影響，發(fā)現(xiàn)GPC3能促進肝癌細胞增殖、遷移及侵潤能力。
　　 2.同時利用質(zhì)粒介導的基因轉染技術成功構建了GPC3表達沉默的肝癌細胞株，進一步驗證了GPC3對肝癌細胞生物學行為有著重要的正性調(diào)節(jié)作用，是肝癌的促癌因子。
　　 3.GPC3過表達（或沉默）能促進（或抑制）磷酸化Akt的表達，故認為，GPC3促進肝癌細胞侵襲轉移

31、作用的部分機制可能是通過促進Akt通路的活化來實現(xiàn)的。
　　 創(chuàng)新之處：
　　 1.成功建立了GPC3過表達細胞株MHCC-97L/GPC3和GP.C3表達沉默細胞株MHCC97-H/GPC3-shRNA1，為進一步深入研究GPC3在肝癌發(fā)生發(fā)展的過程中的作用提供了有效的途徑。
　　 2.初步探索了GPC3促進肝癌侵襲轉移的作用機制，提示GPC3的促腫瘤生長作用和Akt通路存在密切的聯(lián)系，GPC3促進肝癌侵襲轉移