SARS-CoV 7a蛋白的結構與功能初步研究.pdf

1、SARS是近年來爆發(fā)的一種嚴重的呼吸道傳染疾病，SARS-CoV是SARS的病原體?；蚪M測序結果顯示，SARS-CoV除編碼冠狀病毒共有的結構蛋白M、E、S和N蛋白外，還存在6個編碼氨基酸大于50的ORFs，生物信息學分析沒有發(fā)現(xiàn)這些ORFs的同源基因，推測其中可能存在SARS-CoV致病基因。在SARS-CoV特有的這些ORFs中，ORF7a即為其中之一。已有文獻報道在SARS-CoV感染的細胞中可檢測到ORF7a的表達，且其表達能

2、誘導caspase依賴性的細胞凋亡，因此有理由認為7a可能是SARS-CoV的潛在致病基因。本課題擬對7a蛋白進行結構與功能初步研究，以期為揭示SARS-CoV致病的分子機制提供線索。 用免疫細胞化學方法對7a的細胞內定位及拓撲異構性進行研究，發(fā)現(xiàn)其定位于高爾基體，N端朝胞漿，C端朝內腔。同時在實驗中注意到轉染了7a的HEK293細胞與空細胞相比，增殖變得緩慢，推測其可能有增殖抑制作用。于是構建了N端或C端帶有GFP或myc標簽

3、的7a真核表達載體，轉染不同細胞系后檢測細胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)7a的表達可明顯抑制細胞增殖，阻止BrdU摻入，提示7a可能起到細胞周期調控的作用。于是將7a轉染HEK293細胞，轉染后24-60h分別用流式細胞術分析細胞周期，結果顯示，轉染后不同時間點，7a的表達均能引起細胞周期G0/G1期阻滯，且轉染COS-7和Vero細胞也可觀察到相似結果。 為了找到7a中影響其定位和功能的結構域，構建了7a基因的系列缺失突變體，并對其進行定位

4、和相關功能分析，發(fā)現(xiàn)決定7a定位和引起細胞G0/G1期阻滯以及凋亡的區(qū)域均位于蛋白的44-82個氨基酸處。 最后，進一步探索7a引起細胞G0/G1期阻滯的機制。Rb是細胞由G0/G1期進入S期的關鍵調控因子，可結合轉錄因子E2F并抑制其活性。Rb磷酸化受Cyclin/cdk復合物的調節(jié)，Rb高磷酸化后釋放并激活E2F，啟動S期基因轉錄。實驗中我們主要通過Westernblot的方法對這些影響細胞周期進程的蛋白因子進行研究，發(fā)現(xiàn)在

5、HEK293細胞中，7a的表達可顯著降低CyclinD3轉錄水平和蛋白表達水平，明顯抑制細胞內RbSer795和Ser809/811的磷酸化，而對CyclinD1、CyclinD2、cdk4和cdk6的表達沒有明顯影響。提示7a通過下調CyclinD3的表達，降低CyclinD/cdk4/6復合物的活性，抑制Rb磷酸化，Rb磷酸化不足或非磷酸化導致細胞出現(xiàn)G0/G1期阻滯。 綜上所述，在實驗中發(fā)現(xiàn)ORF7a過表達能抑制細胞增殖，