核仁素適配體修飾的雷公藤甲素穩(wěn)定性和細胞選擇性考察.pdf

1、目的:核仁素是一種存在于腫瘤細胞表面的糖蛋白，在胰腺癌細胞表面過表達，是具有重要應用潛能的腫瘤靶標分子。本課題采用一種能與核仁素特異性結合的寡核苷酸適配體作為靶向分子，通過酸性敏感鍵與雷甲素耦聯(lián)，構建一種新型的具有胰腺癌細胞靶向性的雷甲素-核仁素適配體耦合物入胞遞送系統(tǒng)。在體外模擬人體內(nèi)生理環(huán)境，探討雷甲素-核仁素適配體耦合物的穩(wěn)定性，從而推測該耦合物是否能有效遞送至靶部位。此外，以胰腺癌細胞BxPC-3為實驗組，正常胰腺細胞HPC-Y

2、5和正常肝細胞L-02為對照組，考察該遞送系統(tǒng)的靶向性以及與靶細胞的親和性。
　　方法:(1)通過Michael加成的合成方法，將丙炔酸烯丙酯與雷甲素通過形成烯醚鍵的方式鏈接起來;在四三苯基膦鈀的催化條件下，得到了具有高活性的羧酸基團的中間體;最后再利用縮合劑DMT-TT，將雷甲素中間體與適配子通過酰胺鍵鏈接而形成了具有靶向性的雷甲素-核仁素適配子耦合物。(2)以游離雷甲素含量為檢測指標，通過體外模擬人體內(nèi)生理環(huán)境(pH7.5、p

3、H7.0、pH6.8、pH6.5、pH6.0)，采用反相高效液相色譜儀(RP-HPLC)檢測雷甲素-核仁素適配體耦合物于不同時間點在血漿和不同pH值緩沖液中的斷裂情況，計算釋放出的游離雷甲素占耦合物的比例，確定烯醚鍵在不同環(huán)境中的斷裂程度，從而推測該耦合物是否能有效遞送至靶部位。(3)以胰腺癌細胞BxPC-3為實驗組，正常肝細胞L-02和胰腺細胞HPC-Y5為對照組，采用流式細胞儀檢測雷甲素-核仁素適配體耦合物與胰腺癌細胞的結合能力。采

4、用熒光顯微鏡觀察腫瘤細胞對耦合物的攝取情況。
　　結果:(1)雷甲素與丙炔酸烯丙酯在N-甲基嗎啉的催化條件下，以52％的產(chǎn)率得到了白色固體的3-（雷甲素基醚）-丙烯酸烯丙酯，再將其在金屬催化劑條件脫去烯丙基得到了白色固體3-（雷甲素基醚）-丙烯酸，最后在縮合劑的催化下，以50％的產(chǎn)率制備得到白色粉末雷甲素-核仁素適配體耦合物。在各個合成的階段，通過LC-MS，NMR，HPLC等分析方法來監(jiān)測和鑒定目標產(chǎn)物，所得的分析圖譜與目標產(chǎn)物

5、特征相對應符合。(2)雷甲素-核仁素適配體耦合物在生理條件和血漿中穩(wěn)定存在，隨著pH值降低，游離雷甲素含量不斷增加。當pH值降至6.0時，有超過60％的雷甲素從雷甲素-核仁素適配子體中釋放。(3)胰腺癌細胞BxPC-3與核仁素適配體溫育后，熒光強度明顯增強，高于隨機對照。而對照組細胞L-02和HPC-Y5與核仁素適配體溫育后熒光強度與隨機對照一致。BxPC-3細胞與雷甲素-核仁素適配體耦合物溫育后，熒光強度與核仁素適配體產(chǎn)生的熒光強度一

6、致。
　　結論:本研究通過合成小分子化合物丙炔酸烯丙酯，再將其與雷甲素反應，從而構建了具有酸敏感性的烯醚鍵的中間體，最后與適配體縮合而形成的具有靶向性的雷甲素-核仁素適配子耦合物。這是國際上首次將具有酸性敏感的烯醚鍵用于構建核仁素與天然產(chǎn)物所形成的耦合物。該耦合物在生理條件和血漿中穩(wěn)定存在，隨著pH值降低，游離雷甲素含量不斷增加。烯醚鍵可有效確保雷甲素-核仁素適配體耦合物在血漿和生理環(huán)境中穩(wěn)定存在，從而保證該遞送系統(tǒng)成功到達并進入