家蠶成蟲期特異黑化突變從性黑蛾(sml)的定位克隆及分子機制研究.pdf

1、昆蟲是地球上最繁盛的動物類群，種類多，分布廣，形態(tài)多樣。其豐富多樣的體色模式，長期受到世界各國研究者的高度關注，一直是生物學領域的研究熱點。黑化是昆蟲普遍而主要的著色模式，不僅能產生豐富的表型多形性，還在適應性進化等方面起著重要作用。昆蟲的黑化現(xiàn)象主要是由黑色素積累引起的。目前，昆蟲黑色素生物合成過程的基因、蛋白質和相關的代謝物質，在眾多昆蟲中已經被比較系統(tǒng)地研究。然而，越來越多的研究表明，昆蟲黑化除了與黑色素合成代謝途徑的基因密切相關

2、之外，也可能受其他基因或遺傳位點的調控，這表明昆蟲黑化的分子機制復雜多樣，還有待進一步研究。
　　家蠶是重要的農業(yè)經濟昆蟲，也是鱗翅目昆蟲的模式生物，在害蟲防治與生物科學研究上有著重要地位。超過百年的家蠶遺傳學研究為我們累積了大量的體色突變遺傳資源。以往對家蠶體色突變體的大量研究，增強了我們對家蠶色素沉著過程和昆蟲黑化現(xiàn)象的遺傳機制的基本認識，還為進一步闡明昆蟲體色調控機制提供了理論參考和技術支撐。
　　從性黑蛾（sex-c

3、ontrolled melanism,sml）是本研究團隊新發(fā)現(xiàn)的家蠶成蟲期特異黑化突變體。它是一種常染色體隱性自發(fā)突變，且只有sml雄蛾表現(xiàn)出明顯的黑化表型。之前的遺傳分析表明，該黑化突變體不同于以往報道的黑化變異，暗示未知的新基因（新機制）導致了此黑化表型。本研究選擇黑化突變sml作為研究對象，利用定位克隆等多種技術確定變異位點，并對候選基因的相關功能及黑化調控機制進行研究。獲得的主要研究結果如下：
　　1.家蠶從性黑蛾（sm

4、l）的表型觀察與分析
　　為了探明家蠶從性黑蛾（sml）的具體表型特征，我們對其表型進行了連續(xù)的觀察分析。其基本體色特征為：幼蟲和蛹體色為普通型，雄蛾灰黑色（突變型），雌蛾為野生型體色（白色或略帶灰色）。在標準飼養(yǎng)條件下，蛹8天之前，sml雄性個體與其雌性及野生型品系的體色沒有明顯差異；發(fā)育到蛹8天后，sml雄性個體顏色逐漸加深，變黑；進入蛹9天時，sml雄性個體全身黑色；蛹9天的后半天（蛹期持續(xù)約9天）陸續(xù)羽化為黑蛾。通過組織部

5、位的比較觀察結果顯示：sml雄蛾主要表現(xiàn)為鱗片黑化，其背板、觸角以及羽化后的蛹殼等組織部位的顏色與其雌性或野生型個體沒有明顯差異。
　　在幼蟲期對雌雄差異器官（生殖器官原基：生殖腺和生殖芽等）的摘除實驗結果顯示：摘除生殖腺（精巢、卵巢）和生殖芽（雄性為赫氏腺，雌性為石渡氏腺），對sml雌雄個體的蛾體色沒有產生明顯影響。由此推測：生殖腺和生殖芽等生殖腺體對sml成蟲體色沒有決定性的調控作用。
　　對成蟲存活時間的統(tǒng)計分析結果顯

6、示：在未交配的情況下，野生型對照組家蠶品系（普通蛾體色）雌蛾存活時間均比雄蛾長，且差異顯著；sml雌蛾（普通蛾體色）的存活時間與對照組相當，而sml雄蛾（黑化）存活時間顯著延長，并且顯著長于雌蛾。表明：sml黑化個體（雄性黑蛾）存活時間更長。這一結果暗示：在某些情況下，昆蟲的黑化可能會增強個體的生命力，延長存活時間。
　　2.家蠶從性黑蛾（sml）的轉錄組測序分析
　　為了全面地調查與sml雄蛾突變表型相關的轉錄組水平信息，

7、我們選用開始黑化（蛹8天）的sml和野生型Dazao品系（分雌雄）樣本，進行轉錄組測序比較分析。4個樣品文庫依次為：sml雄（編號為 sml_M），sml雌（編號為 sml_F）。Dazao雄（編號為DZ_M）和Dazao雌（編號為DZ_F）。
　　3個黑-白配對比較組（sml_MVS sml_F，sml_MVSDZ_M和sml_MVSDZ_F）分別有168、503和623個差異表達基因（DEGs）。我們通過構建維恩圖排除因遺傳背

8、景和性別差異導致的差異表達基因后，共篩選到59個主要與黑化表型相關的DEGs。
　　基于轉錄組表達數(shù)據(jù)和功能注釋，我們分析發(fā)現(xiàn)：與三個白蛾樣本相比，這59個DEGs在黑蛾樣本（sml雄）中有49個基因上調表達，10個基因下調表達；其中有24個（約占59個候選DEGs的41％）表皮蛋白基因，包括7個CPR（含R&R共有序列的表皮蛋白）、7個CPG（富含甘氨酸的表皮蛋白）、1個CPT（含Tweedle基序的表皮蛋白）和9個CPH（假定

9、表皮蛋白）基因。22個表皮蛋白基因的表達量在黑蛾樣本（sml雄）中顯著上調，暗示這些表皮蛋白基因與sml黑化表型相關（如：可能參與黑色素轉運或附著）。另外我們發(fā)現(xiàn)：昆蟲黑色素生物合成過程的2個關鍵基因laccase2（BGIBMGA006745）和yellow（BGIBMGA001149），在sml黑蛾樣本中表達量顯著上調，暗示sml黑化基因能通過上調yellow和laccase2的基因表達量，調節(jié)家蠶黑色素生物合成通路，進而產生黑蛾表

10、型。同時，我們發(fā)現(xiàn)laccase2 B亞型轉錄本（BGIBMGA006746）也在sml黑蛾樣本中顯著高表達，說明該亞型可能參與家蠶蛹后期及其后的黑化過程。除此之外，我們還在候選DEGs中發(fā)現(xiàn)1個過氧化氫酶基因（BGIBMGA011430）和1個胰島素類似蛋白基因（家蠶素E-1，BGIBMGA000667）。據(jù)報道，這兩類蛋白可以影響生物壽命，這可能為研究sml成蟲期壽命延長現(xiàn)象的分子機理提供重要線索。
　　3.從性黑蛾（sml）

11、位點的分子定位分析
　　利用分布于家蠶各連鎖群（染色體）的形態(tài)標記和簡單重復序列（Simple Sequence Repeat，SSR）分子標記對sml進行連鎖分析，結果顯示：sml位點與位于第17連鎖群（第17染色體）的分子標記連鎖，而與其它連鎖群的分子或形態(tài)標記均為獨立遺傳關系，由此判斷sml突變位點位于家蠶第17染色體。
　　我們利用分子標記和小規(guī)模定位群體（159個BC1M個體）對sml位點進行了初步定位，并構建了分

12、子標記連鎖圖譜，將 sml位點初步鎖定在17號染色體nscaf2829上的分子標記M3和M11之間。sml位點與M3和M11的遺傳距離分別為1.9cM和3.1cM。在初定位區(qū)間中補充新的分子標記后，我們利用大規(guī)模的定位群體（1573個BC1M個體）進行了精細定位，最終將sml位點鎖定在標記M5和M9之間，區(qū)間長度約403kb，且在區(qū)間內發(fā)現(xiàn)3個與sml位點緊密連鎖（不交換）的標記（M6、M7和M8）。
　　蛾體色是家蠶的一個馴化性

13、狀。因此，我們通過ROD（reduction of diversity）法，對多個品系的家蠶（白蛾）和野蠶（蛾體色黑，斑紋偏多）的基因組重測序數(shù)據(jù)的SNP（Single Nucleotide Polymorphisms單核苷酸多態(tài)性）進行了分析，篩查了家蠶基因組中的馴化選擇靶點，并通過Tajima’D檢驗等方法驗證靶點的可靠性。結果表明：sml定位區(qū)間受馴化選擇強度較大，是家蠶馴化選擇的候選靶點，說明該區(qū)域與蛾體色調控和馴化緊密相關。<

14、br>　　4.候選基因篩查、克隆及功能研究
　　定位區(qū)間內共有23個預測基因。為了篩選候選基因，我們采用熒光定量PCR技術調查區(qū)間內基因的表達，發(fā)現(xiàn)區(qū)間內有4個基因（BGIBMGA005552、BGIBMGA005557、BGIBMGA005652和BGIBMGA005662）在sml突變體中的表達量顯著低于野生型Dazao。
　　基因功能注釋結果顯示：BGIBMGA005652是保守的細胞周期調控因子 fizzy基因家族成

15、員，它在袖蝶中的同源基因（poik）能調控擬態(tài)的色彩模式；BGIBMGA005557編碼一個ATP結合蛋白，具有轉移酶活性和核苷酸磷酸酶活性，在果蠅中的直系同源基因能調控翅的形態(tài)發(fā)生；BGIBMGA005552編碼一個平滑肌鈣調素結合蛋白，其在果蠅中的直系同源基因參與神經細胞的發(fā)育過程；BGIBMGA005662編碼一個WD40重復結構域蛋白，在果蠅中的直系同源基因有去甲基化酶活性。
　　我們克隆了sml突變中這幾個基因的cDNA

16、及基因組序列，并且分析比較了它們與野生型序列的差異。結果顯示：與野生型Dazao相比。sml中基因BGIBMGA005557的轉錄區(qū)和基因上下游均有大量的短片段的插入缺失和堿基替換突變，致使ORF框被破壞，無法正常翻譯為功能蛋白；基因BGIBMGA005652上游約5kb的位置有一段長約20kb的大片段缺失；基因BGIBMGA005552的轉錄起始位點上游有短片段的插入突變和大量堿基替換變異；基因BGIBMGA005662內含子和轉錄區(qū)

17、下游有短片段的插入突變和大量堿基替換變異。
　　為了驗證這幾個候選基因的缺陷是否能導致黑化表型，我們通過 RNAi技術,下調了它們在野生型個體中的mRNA表達量,結果顯示，下調BGIBMGA005552、BGIBMGA005557和BGIBMGA005652基因表達量后，野生型蠶蛾產生不同程度的黑化表型；在基因BGIBMGA005662 RNAi干涉組中未見黑化表型個體。我們推測，基因BGIBMGA005552、BGIBMGA00

18、5557和BGIBMGA005652均參與家蠶成蟲體色調控，sml的黑化表型可能是由多基因的功能缺陷或異常表達共同導致的。
　　由于sml雄蛾表現(xiàn)為黑化表型，而前期的轉錄組實驗結果也顯示突變體中黑色素生物合成過程中的部分基因表達異常，所以我們采用熒光定量PCR技術調查了黑色素生物合成過程中關鍵基因的表達模式。結果顯示：黑色素形成和沉積過程中的關鍵基因yellow和laccase2在野生型個體蛹復眼著色后有一個表達高峰；它們在sml

19、雄蛾（黑化）中的表達模式與野生型相似，但表達量顯著的高于野生型，且yellow基因在蛹7天的相對表達水平極高；其余基因的表達差異不明顯。由此我們推測，sml的候選基因能通過控制蛹后期yellow和laccase2的基因表達水平（主要是yellow基因），調節(jié)黑色素的生物合成，進而調控家蠶蛾體色。
　　5.鱗翅目昆蟲中sml同源區(qū)域的生物信息分析
　　在不同鱗翅目昆蟲物種中，對sml位點所在的基因組區(qū)域進行了同源比對和生物信息

20、分析。研究發(fā)現(xiàn)，sml的候選基因組區(qū)域與其它鱗翅目昆蟲的體色調控區(qū)域（HmYb、P、Cr和 carbonaria）同源，表明此區(qū)域是鱗翅目昆蟲中控制成蟲體色模式的保守調控位點。同時我們還發(fā)現(xiàn)。sml位點中有2個候選基因BGIBMGA005557和BGIBMGA005652位于樺尺蠖工業(yè)黑化核心調控區(qū)域的同源區(qū)域中。樺尺蠖工業(yè)黑化現(xiàn)象是自然選擇的一個經典案例，但先前的研究只鑒定了控制工業(yè)黑化的染色體區(qū)域carbonaria。值得注意的是，