涼血化瘀方治療濕性老年性黃斑變性回顧臨床研究及作用機制探討.pdf

1、研究目的：
　　客觀評價葛根素及銀杏葉提取物對眼血流的改善作用；從分子生物學的角度研究葛根素及銀杏葉提取物對視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞及脈絡膜血管內(nèi)皮細胞分泌eNOS及ET-1的影響，初步探討葛根素及銀杏葉提取物改善視網(wǎng)膜、脈絡膜血流的分子生物學機制，為臨床用藥提供客觀依據(jù)和指導，同時也為今后研究活血中藥提供新的思路和方法。
　　研究方法：
　　1.選取前部缺血性視神經(jīng)病變患者41名，隨機分為2組，進行葛根素或銀杏葉提取物注射

2、液靜脈點滴聯(lián)合口服補陽還五湯治療，運用彩色超聲多普勒技術比較用這兩種藥物治療前后患者患眼動脈及視網(wǎng)膜中央動脈的收縮期峰值血流速度、舒張術期血流速度及阻力指數(shù)，采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對各組參數(shù)進行比較和分析。
　　2.選取前部缺血性視神經(jīng)病變患者41名，隨機分為2組，進行葛根素或銀杏葉提取物注射液靜脈點滴治療，運用球結膜微循環(huán)監(jiān)測技術比較用這兩種藥物治療前后患者的球結膜的血流有無變化，采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對各組加權積分

3、進行比較和分析。
　　3.分別培養(yǎng)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞及脈絡膜血管內(nèi)皮細胞，用MTT法檢測葛根素及銀杏葉提取物對這兩種細胞增殖活性的影響；采用蛋白免疫印跡法檢測葛根素及銀杏葉提取物對視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞及脈絡膜血管內(nèi)皮細胞分泌eNOS及ET-1的影響。
　　研究結果：
　　1.葛根素及銀杏葉提取物聯(lián)合口服補陽還五湯治療后患者眼動脈PSV治療后較治療前明顯增加，且治療前后差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，EDV治療后較治療前

4、增加，但治療前后差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，RI治療后較治療前降低，但治療前后差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；患者視網(wǎng)膜中央動脈PSV治療后較治療前明顯增加，且治療前后差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，EDV治療后較治療前增加，但治療前后差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，RI治療后較治療前降低，但治療前后差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　2.葛根素組輸液后球結膜微循環(huán)加權積分小于輸液前積分，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.

5、05)；銀杏葉提取物組輸液后球結膜微循環(huán)加權積分小于輸液前積分，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　3.培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞的鑒定：Ⅷ因子定位于胞漿中，免疫熒光化學顯示所培養(yǎng)細胞胞漿中有黃綠色的熒光著色，胞核呈黑綠色，整個細胞輪廓清楚，表明細胞為內(nèi)皮源性細胞。
　　4.內(nèi)皮細胞培養(yǎng)的關鍵因素：20 g·L-1明膠可獲得較高的細胞貼壁率；此外，內(nèi)皮細胞完全培養(yǎng)基的使用對內(nèi)皮細胞的維持培養(yǎng)非常關鍵。本研究采用DMEM及Ham’F1

6、2作為基礎培養(yǎng)基，添加胎牛血清、ECGF以及肝素，結果表明已可滿足內(nèi)皮細胞的生長；胎牛血清的濃度及質(zhì)量對內(nèi)皮細胞的生長也有至關重要的作用；內(nèi)皮細胞還是密度依賴性生長的細胞，接種的細胞太稀，將不利于細胞的生長，3×104個/ml的密度較利于內(nèi)皮細胞的生長。
　　5.MTT比色法檢測葛根素對視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的作用，結果顯示葛根素對視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞生長有明顯的促進增殖效應。24及48h五個濃度葛根素組0D值均高于空白對照組(P<0.

7、05)，視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞增殖明顯，并且隨藥物濃度增加0D值也增加，說明葛根素有促進視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞增殖的作用；MTT比色法檢測銀杏葉提取物對RVECs的作用，結果顯示24 h五個濃度銀杏葉提取物組0D值均高于空白對照組(P<0.05)，血管內(nèi)皮細胞增殖明顯。48h0.001、0.01、0.1μ g/ml三個濃度0D值均高于空白對照組(P<0.05)：0.0001μ g/ml組0D值高于空白對照組，但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；1μ

8、 g/ml組0D值低于空白對照組(P<0.05)，說明銀杏葉提取物有促進視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞增殖的作用。
　　6.MTT比色法檢測葛根素對脈絡膜血管內(nèi)皮細胞的作用，結果顯示24及48h四個濃度葛根素組0D值均高于空白對照組(P<0.05)，脈絡膜血管內(nèi)皮細胞增殖明顯，并且隨藥物濃度增加0D值也增加，說明葛根素有促進脈絡膜血管內(nèi)皮細胞增殖的作用；MTT比色法檢測銀杏葉提取物對脈絡膜血管內(nèi)皮細胞的作用，結果顯示24及48h四個濃度銀杏葉

9、提取物組0D值均高于空白對照組(P<0.05)，脈絡膜血管內(nèi)皮細胞增殖明顯，并且隨藥物濃度增加0D值也增加，說明銀杏葉提取物有促進脈絡膜血管內(nèi)皮細胞增殖的作用。
　　7.與陰性對照組相比，銀杏葉低濃度及高濃度組、葛根素低濃度及高濃度組eNOS的相對表達量均升高(P<0.01)，且隨著藥物濃度的增加eNOS的表達也增加；銀杏葉低濃度及高濃度組、葛根素低濃度及高濃度組ET-1的相對表達量均下降(P<0.01)，銀杏葉組低濃度及高濃度組

10、間ET-1的相對表達量無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，葛根素組ET-1的表達隨著藥物濃度的增加而下降，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)
　　研究結論：
　　1.本研究發(fā)現(xiàn)葛根素及銀杏葉提取物聯(lián)合口服補陽還五湯治療后能提高AION患者眼部眼動脈和視網(wǎng)膜中央動脈的灌注壓，改善眼動脈和視網(wǎng)膜中央動脈的血流速度，從而改善視神經(jīng)的缺血狀態(tài)。為了觀察單獨應用葛根素及銀杏葉提取物后對眼血流的作用，本研究還進行了單次輸液前及輸液后30分

11、鐘對球結膜血流的檢測，發(fā)現(xiàn)葛根素及銀杏葉提取物還能改善AION患者球結膜的血流，據(jù)此推測葛根素及銀杏葉提取物可以改善眼動脈及睫狀前動脈的血流。所以綜合彩色多普勒血流顯像及球結膜血流的觀測結果，可以推測葛根素及銀杏葉提取物能改善AION患者眼部的血流量，不僅能改善視網(wǎng)膜的血供，也能改善脈絡膜的血供。
　　2.無論是體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞還是脈絡膜血管內(nèi)皮細胞，加藥組的eNOS表達量均增加，ET-1的表達均下調(diào)，據(jù)此可以推測葛根