辣椒素和阿托他汀對心肌重構的機制研究.pdf

1、背景和目的：
　　 近年來心力衰竭的治療取得了一定的進展，但其發(fā)病率和死亡率在全世界范圍內仍然居高不下。因此，探討好的治療方法及研制新的藥物是醫(yī)學界亟待解決的問題。心力衰竭是一組臨床上極為常見的心血管綜合征，冠心病、高血壓、心肌梗塞、心律失常、瓣膜異常都可引起心力衰竭。心衰時對心臟構和功能的研究經歷了相當長的時期，直到20試劑90年代才意識到心衰發(fā)生發(fā)展的基礎是心室重構，心室重構是心衰患者發(fā)病率和死亡率的決定因素。心室重構是指心

2、臟受到損傷后基因表達、分子、細胞和心肌間質的變化，臨床表現為心臟大小、形狀和功能的改變。心室重構的調節(jié)主要包括腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、炎性細胞因子系統(tǒng)、機械應激、氧化應激、高鹽、高糖、轉化生長因子等都能在一定程度上影響心室重構的進行。
　　 心臟通過能量代謝將儲存于脂肪酸或葡萄糖中的化學能轉化為機械能，為心臟收縮和舒張?zhí)峁┠芰俊４x底物從脂肪酸到葡萄糖利用的適應性轉換在心肌重構的病理生理過程中起到關鍵性作用。糖脂代謝異?？?/p>

3、通過影響心肌能量代謝，促使心肌代謝重構。鹽是高血壓、心肌肥厚重要的環(huán)境因素，鹽代謝異?？赏ㄟ^增加氧化應激，促使心肌重構。本研究從脂質，高鹽兩個方面對心肌重構進行探討。
　　 過氧化物酶增殖體激活受體γ共活化因子-1(PGC-lα)在高代謝率的組織表達較高，例如心臟，肌肉和棕色脂肪組織。PGC-1α和核受體家族或是非核受體家族相互作用，來調控不同的細胞能量代謝通路，在心肌肥厚和心衰的進展中PGC-1α起著重要的作用。例如，PGC-

4、1α和雌激素相關受體作用，來調節(jié)丙酮酸脫氫酶4(PDK4)，通過對PDK4的調控，從而完成對葡萄糖氧化的調節(jié)。文獻報道，在心肌肥厚的發(fā)展中，心肌對葡萄糖的利用增加，PGC-1α和PDK4的蛋白表達受到抑制，都是其特征性的表現。UCP2在心肌中大量表達，減少ROS產生和減輕氧化應激反應，iNOS表達上調可增加心肌纖維化、心肌硝基化和啟動心肌重構等。PPARδ可激活UCP2、減少iNOS表達，減輕氧化應激，改善心肌重構。
　　 他汀

5、類藥物(HMG-CoA還原酶抑制劑)是臨床上廣泛應用的降脂藥物，人們發(fā)現他汀類藥物產生的獲益遠大于降脂作用本身善內皮功能現已發(fā)現和證實的作用包括改善血管內皮功能、抗炎、抗氧化、穩(wěn)定斑塊、改善凝血功能、減少神經內分泌激活、刺激內皮祖細胞分化、逆轉心肌重構、減少骨質吸收及抗腫瘤等多效性。鹽是高血壓，心肌肥厚重要的環(huán)境因素，鹽的攝入與高血壓患病率呈明顯的量效關系，我國心血管病的發(fā)病率率呈北高男低的特點。而我國南北方飲食有顯著差異，北方喜食高鹽

6、，云、貴、川居民喜食辣椒食品，已報道辣椒素能調節(jié)高鹽誘導血壓升高。基于以上背景，我們提出如下科學假說：阿托伐他汀是否能夠通過對PGC-1α的調節(jié)，而改善炎性狀態(tài)下的心肌的糖脂代謝紊亂，逆轉心肌重構？辣椒素激活TRPV1調節(jié)高鹽誘導的血壓的同時，是否能改善高鹽誘導心肌重構？
　　 材料與方法：
　　 第一部分：胚胎來源的大鼠心肌細胞系H9c2，在DMEM培養(yǎng)基(10％的胎牛血清)中生長，種植的密度維持在5，000 cell

7、s/cm2，培養(yǎng)基每兩天更換一次，細胞在5%CO2 and95% O2條件下生長。待近于融合時，更換成無血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。細胞分組有H9c2 cells，H9c2+TNF-α，H9c2+TNF-α+Atorvastatin，siPGC-1α分別進行了研究。第二部分：采用離體實驗和在體實驗。在體實驗C57BL/6J野生型(WT)和TRPV1基因敲除(TRPV1-/-)小鼠作為研究對象進行飲食干預，離體實驗以辣椒素刺激心肌細胞

8、為研究對象。WT和TRPV1-/-小鼠隨機分為普食組(NS組)，高鹽組(HS)，高鹽加辣椒素組(HS+Cap)干預1年，從2月齡開始。
　　 1.心肌細胞H9c2培養(yǎng)，用TNF-α刺激，同時用阿托伐他汀干預細胞我們檢測以上各組的葡萄糖氧化率。
　　 2.心肌細胞H9c2培養(yǎng)，用TNF-α刺激，同時用不同濃度的阿托伐他汀干預細胞1-25μmol/L持續(xù)24小時，后收集細胞提蛋白行western檢測PGC-1α的抗體。同時給

9、予甲羥戊酸，金合歡醇，龍牛兒基龍牛兒醇等觀察阿托伐他汀對所起的作用和這幾種物質的關系。
　　 3.細胞分組有H9c2 cells，H9c2+TNF-α，H9c2+TNF-α+Atorvastatin，干預結束后，提蛋白行western檢測PDK4和CPT1
　　 4.用RNA干擾技術，敲減PGC-1α后檢測心肌細胞中PDK4和CPT1的蛋白表達情況，
　　 5.心肌細胞分組control，GFP+TNF-α，si

10、PGC-1α+TNF-α，然后檢測各組的葡萄糖的氧化率。
　　 6.用蛋白免疫印跡檢測TRPV1蛋白的表達；用免疫熒光染色觀察TRPV1在H9C2心肌細胞的具體分布。
　　 7.比率熒光成像系統(tǒng)檢測辣椒素刺激下H9C2心肌細胞[Ca2+]i的變化，觀察TRPV1特異性拮抗劑iRTX對鈣信號變化的影響。
　　 8.用超聲評價各組小鼠的心功能。
　　 9.檢測各組小鼠的心臟重量/體重，應用Masson染色檢測

11、膠原沉積，DHE染色檢測超氧陰離子水平，組織切片HE染色觀察肥厚指標。
　　 10.檢測心臟組織的蛋白表達PPAR-δ，inos，ucp2。
　　 11.檢測心肌細胞PPAR-δ蛋白表達。
　　 結果：
　　 1.TNF-α誘導心肌細胞葡萄糖氧化率顯著增加，而用阿托伐他汀共培養(yǎng)后顯著抑制了這種增加。
　　 2.阿托伐他汀對抗TNF-α誘導的心肌細胞PGC-1α的下調，并呈計量依賴性的，但這種下調和

12、甲羥戊酸，金合歡醇有關，而與龍牛兒基龍牛兒醇無關。
　　 3.TNF-α刺激心肌細胞后，會使PGC-1α，PDK4，CPT1顯著下調，而阿托伐他汀能逆轉TNF-α的這種效果。
　　 4.在心肌細胞中敲減PGC-1α，而PGC-1α的靶基因PDK4，CPT1顯著下調。
　　 5.在心肌細胞中敲減PGC-1α，使得葡萄糖氧化率顯著升高。
　　 6.TRPV1在H9C2心肌細胞和小鼠心肌組織均有表達。
　

13、　 7.辣椒素刺激H9C2心肌細胞引起濃度依賴性的[Ca2+]i升高，TRPV1特異性拮抗劑iRTX預處理可抑制這種細胞內鈣信號的變化。
　　 8.高鹽飲食誘導使心功能惡化，辣椒素能改善高鹽誘導的心功能。而在TRPV1-/-小鼠沒有觀察到這種效果。
　　 9.長期高鹽飲食誘導使心肌肥厚和纖維化，而辣椒素能改善高鹽誘導的肥厚，纖維化。
　　 10.辣椒素能上調高鹽誘導后心肌組織中的PPAR8，UCP2蛋白表達，而

14、減少iNOS的表達。
　　 11.辣椒素能上調心肌細胞中PPARδ的蛋白表達。
　　 結論：
　　 1.TNF-α誘導心肌細胞葡萄糖氧化率顯著增加，而阿托伐他汀對抗了這種增加。而且相應的蛋白表達發(fā)生了改變，TNF-α刺激導致了PGC-1α，PDK4 and CPT1的蛋白表達顯著下調，阿托伐他汀同時也逆轉了這些蛋白的下調，同時阿托伐他汀對抗PGC-1α的下調呈濃度依賴性的。
　　 2.在心肌細胞中我們應用

15、滿病毒系統(tǒng)，敲減PGC-1α，同時檢測了PGC-1α相關的蛋白PDK4，CPT1顯著下調。而心肌細胞的葡萄糖的氧化率也在PGC-1α，敲減后，顯著的增加。
　　 3.阿托伐他汀對抗炎癥狀態(tài)下心肌細胞葡萄糖氧化率的增加和PGC-1α上調有關，這些變化可能和類異戊烯的代謝物有關。
　　 4.辣椒素激活TRPV1能減輕高鹽攝入誘導的氧化應激，減少超氧陰離子產生，改善高鹽膳食導致的心功能的損傷，減輕高鹽攝入導致的心肌肥厚。