HMGB1對結(jié)腸癌組織淋巴管生成的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的 侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本特征，也是腫瘤患者死亡的主要原因之一。淋巴道是大部分腫瘤最常見的轉(zhuǎn)移途徑，有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也是判斷患者預(yù)后的重要指標(biāo)。近年來隨著淋巴管標(biāo)記物以及淋巴管生成因子的發(fā)現(xiàn)，文章報道腫瘤細(xì)胞可通過自分泌或旁分泌內(nèi)皮細(xì)胞生長因子C/D(VEGF-C/D)，誘導(dǎo)腫瘤淋巴管生成，增加腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的幾率。結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，淋巴道轉(zhuǎn)移是其最常見的轉(zhuǎn)移方式。因此了解結(jié)腸癌淋巴管生成情況及其影響干

2、預(yù)因素，對加深其淋巴道轉(zhuǎn)移機(jī)制的理解和今后的治療都有相當(dāng)重要的意義。 高遷移率蛋白B1(HMGBl)最早發(fā)現(xiàn)可作為一種小分子量DNA結(jié)合蛋白在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。近年來發(fā)現(xiàn)它不僅可作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，還可以在細(xì)胞外發(fā)揮作用。通過與其受體晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)結(jié)合，在炎癥，細(xì)胞遷移、分化，腫瘤發(fā)生、發(fā)展等過程中發(fā)揮重要作用。在體內(nèi)，HMGB1主要來自損傷或壞死細(xì)胞，或被缺氧、內(nèi)毒素、TNF-α、IL-1β等因素活化的巨

3、噬細(xì)胞。通過活化的巨噬細(xì)胞分泌的HMGB1可再度激活巨噬細(xì)胞，使其分泌VEGF、TNF-α、IL-8等多種細(xì)胞因子。而據(jù)報道VEGF-C/D的表達(dá)與多種炎癥因子有關(guān)。 已有研究報道HMGB1在腫瘤血管生成方面有一定的影響，而在淋巴管生成方面則未見相關(guān)研究。因此，我們擬通過檢測HMGB1對結(jié)腸癌組織淋巴管生成因子VEGF-C/D表達(dá)的影響及其機(jī)制的研究，了解其是否對結(jié)腸癌的淋巴管生成，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響，從而對結(jié)腸癌發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移

4、的機(jī)制進(jìn)行初步探討。 研究方法 首先，通過免疫組化的方法，檢測結(jié)腸癌組織中HMGB1、VEGF-C/D的表達(dá)情況，同時利用統(tǒng)計學(xué)方法，分析HMGB1表達(dá)同VEGF-C/D表達(dá)、淋巴管計數(shù)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及其他一些臨床病理特征的相關(guān)性。 其次，體外培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞，并以HMGB1作為刺激因子，通過RT-PCR、western blot等方法，檢測其對兩種細(xì)胞VEGF-C/D表達(dá)的影響。并針對在胞外，H

5、MGB1主要通過其受體RAGE來激活多種細(xì)胞通路的情況，構(gòu)建NF-κB干擾載體，通過比較HMGB1對干擾組細(xì)胞和對照組細(xì)胞的VEGF-C/D表達(dá)的影響，分析判斷HMGB1對VEGF-C/D表達(dá)影響的通路。最后，構(gòu)建HMGB1表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116，篩選HMGB1高表達(dá)細(xì)胞。采用背部皮下種植的的方法造成裸鼠荷瘤模型。比較轉(zhuǎn)染組與對照組種植瘤在淋巴管生成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面的差異。 結(jié)果 在結(jié)腸癌組織切片免疫組化

6、檢測中，可觀察到HMGB1表達(dá)于癌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在70例標(biāo)本中，陽性率72.9％；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者與無轉(zhuǎn)移的患者之間，HMGB1的陽性率差異顯著(P<0.05)。VEGF-C/D也表達(dá)于癌細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。在腫瘤周圍正常組織中則基本沒有表達(dá)。二者中以VEGF-C表達(dá)多見。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的VEGF-C陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者的陽性率，差異有統(tǒng)計意義。結(jié)腸癌組織中HMGB1和VEGF-C/D的表達(dá)在病人的年齡、性別、分化程度等

7、方面差異不顯著(P>0.05)。通過免疫組化雙染觀察到結(jié)腸癌相關(guān)巨噬細(xì)胞可同時表達(dá)HMGB1、VEGF-C/D，而且經(jīng)統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)HMGB1、VEGF-C/D的表達(dá)及巨噬細(xì)胞計數(shù)三者之間存在相關(guān)性(P<0.05)。結(jié)腸癌組織中淋巴管計數(shù)也與HMGB1、VEGF-C有關(guān)。 在體外實驗中，通過不同濃度與時間的HMGB1刺激，經(jīng)檢測mRNA與蛋白表達(dá)的改變。發(fā)現(xiàn)VEGF-C的表達(dá)與HMGB1呈量效關(guān)系。在作用時間上，VEGF-C表達(dá)

8、增強在HMGB1刺激后12小時達(dá)高峰，而VEGF-D則在4小時就達(dá)峰值。在轉(zhuǎn)染NF-κB干擾載體后，發(fā)現(xiàn)可抑制HMGB1對VEGF-C/D的誘導(dǎo)作用。由此可推測HMGB1與受體結(jié)合后可通過活化NF-κB途徑來誘導(dǎo)VEGF-C/D的表達(dá)。 在動物體內(nèi)實驗中，成功構(gòu)建了HMGB1表達(dá)載體并順利轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞。轉(zhuǎn)染HMGB1的HCT116細(xì)胞裸鼠移植瘤與對照組移植瘤相比較，生長相同天數(shù)后，轉(zhuǎn)染組淋巴管計數(shù)多于未轉(zhuǎn)染組，并有統(tǒng)計學(xué)

9、意義。 結(jié)論 本文通過研究結(jié)腸癌組織中HMGB1對VEGF-C/D表達(dá)的影響及其機(jī)制。認(rèn)為(1)結(jié)腸癌組織中HMGB1及VEGF-C/D表達(dá)于多種細(xì)胞(結(jié)腸癌細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞)，并且和腫瘤淋巴管生成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性。(2)HMGB1可誘導(dǎo)VEGF-C/D在結(jié)腸癌細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞中的表達(dá)。(3)HMGB1在與受體結(jié)合后可通過NF-κB影響到VEGF-C/D的表達(dá)。(4)hMGB1可通過影響腫瘤局部微環(huán)境中VE