人可溶性TRAIL的基因克隆及其抑制C6膠質瘤的實驗研究.pdf

1、浙江大學博士學位論文人可溶性TRAIL的基因克隆及其抑制C6膠質瘤的實驗研究姓名：裘五四申請學位級別：博士專業(yè)：外科學（神經外科）指導教師：劉偉國楊小鋒20070516浙江大學醫(yī)學院博士學位論文一裘五四中英文摘要2、引物設計根據GenBank數據，用引物設計軟件DNAstar設計sTRAIL基因引物如下：上游：5GCGAATTCAGl=ATGGTGAGAGAAAGAGGTC3；下游：5ACAG，I姍A=rCCrCCAGGTCAGr聃。(

2、挖CA3。3、總RNA提取與目的基因的克隆無菌條件下取小塊人脾臟組織，碾磨勻漿，嘲zol一步法提取總RNA。嚴格按照AccessRTPCRSystem說明書，以人脾臟總RNA為模板由下游弓l物引導，進行RT反應。以RT產物為模板，由上述上、下游引物引導，進行PCR擴增。PCRj6：物電泳，將540bp附近出現的特異性條帶切膠回收、提純即得到目的基因。將目的基因連接PuCm—T載體并轉化感受態(tài)大腸桿菌進行擴增，獲得純化質粒并初步酶切鑒定后

3、送上海生工公司進彳亍序列測定。4、構建真核表達載體TsTRAIL經測序鑒定證實克隆成功，EcoRI和BamH4雙酶切，切膠回收541bp的sTRAIL片段。與EcoR_I和BanlHI雙酶切的真核表達載體PcDNA31連接。所得重組質粒命名為PcDNAsTRAIL。5、PcDNA椰AⅡ對膠質瘤增殖的影響：利用Mrr等技術，體外檢測PeDNAsTRAIL轉染后的膠質瘤細胞的抑制作用；建立裸鼠膠質瘤模型，體內實驗觀察PcDNAmAⅡ尉膠質瘤

4、的治療作用。結果l、無菌條件下提取小塊人脾臟組織總RNA，經凝膠電泳，EB染色，紫外線燈下28S和18S條帶清晰可見，提示RNA降解。2、RTPCR結果PcR產物經凝膠電泳與分子質量標記比較顯示約可見540bp處有一特異性條帶，與預期sTRAIL基因分子量吻合，切膠回收。3、酶切鑒定與序列測定TsTRAIL經EcoRI和BamhI雙酶切，電泳可見兩條特異性條帶，大小分別為Ikb和540bp左右，與預期(大小分別為Ikb和541bp)符合